[发明专利]一种组培用油菜种子的灭菌方法

说明书

本发明公开了一种组培用油菜种子的灭菌方法，先将种子放在水中浸泡1 h，去除浮在水面上的种子，自来水冲洗2遍，转移至超净工作台内，75%酒精处理消毒1 min，用3%NaClO灭菌种子15min（期间保持晃动转态），再用无菌水冲洗5‑6次，最后将种子转移至无菌滤纸上晾干即可。其中，3%NaClO是从0%‑30%NaClO灭菌种子效果中筛选出的最佳灭菌浓度，灭菌15min是用最佳浓度3%NaClO灭菌种子10min‑30min中筛选到的最佳灭菌时间。本发明可以获得最多的健康苗用于转基因油菜的生产，从而提高油菜基因转化的成功率。

技术领域

本发明涉及植物组织培养领域，具体涉及一种组培用油菜种子的灭菌方法。

背景技术

油菜属十字花科芸苔属植物，是一种重要的油料作物，其产品既可以加工成人类食用油、工业润滑油，也可以作为绿肥和堆肥。据报道，在2014-2015年间，全球的菜籽油产量超过269.8万吨，为第三大产油植物。通过转基因技术快速获得理想性状油菜栽培种，现在已被广泛使用，据国际农业生物技术应用服务组织（ISAAA）统计，2016年转基因作物种植面积达1.851亿公顷，且全球种植的油菜有24%为转基因品种（http://www.isaaa.org），获得转基因油菜的普遍做法是农杆菌介导转化法，通过组织培养获得转基因油菜，而组织培养技术的第一步就是油菜种子的无菌化处理，种子灭菌是转基因油菜成功的关键。

目前使用最多的油菜种子灭菌剂为次氯酸钠（NaClO），值得注意的是如果使用的NaClO浓度过低或灭菌时间不够，种子灭菌就不彻底，播种后容易滋生病原菌，苗容易被病原菌感染；浓度过高或灭菌时间过久，则会损伤种子，令种子发芽不正常甚至无法发芽，无法获得足够的苗用于转基因研究，而目前报道的NaClO使用浓度从0.1%到50%，灭菌时间从6min到45 min不等，这为转基因油菜研究的应用推广带来了极大的困难。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明旨在提供一种组培用油菜种子的灭菌方法，用不同浓度的NaClO灭菌油菜种子不同时间来筛选出最适合的种子灭菌浓度和灭菌时间，提高油菜种子灭菌效率。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种组培用油菜种子的灭菌方法，包括如下步骤：

（1）先将组培用油菜种子放在水中浸泡1 h，去除浮在水面上的种子；

（2）用自来水冲洗2遍；

（3）用75%酒精处理消毒1 min；

（4）用0% - 30% NaClO灭菌10 - 30 min；

（5）用无菌水冲洗5 - 6次，最后用无菌滤纸吸去种子上的水份；

（6）将种子播种到MS种子萌发培养基上；

（7）播种5日后，统计种子发芽率、健康芽率和菌落数。

优选的，步骤（4）中，NaClO浓度为3%，灭菌种子时间为15 min。

步骤（6）中，MS种子萌发培养基为：MS 培养基2.22 g/L + 蔗糖30 g/L + 琼脂粉8g/L，pH值为5.8。

步骤（6）中，培养环境为：25℃、相对湿度60% - 70%，前2日全暗处理，后3日2000lx光照16 h/日。

本发明的优点在于：

本发明处理方法通过比较目前报道的NaClO灭菌浓度和时间，得到了用NaClO灭菌油菜种子的最佳浓度和时间，在节约了NaClO的使用成本的同时，又节省了种子灭菌的操作时间，在不影响种子发芽率的基础上，又可以获得最多的健康芽率，获得足够的健康苗用于油菜的转基因研究。本发明为油菜的遗传转化研究奠定了坚实的基础，可以提高油菜转基因用的外植体数量，从而提高遗传转化的效率。