[发明专利]参与西红花苷合成的糖基转移酶GjUGT94E13和GjUGT74F8的筛选鉴定及应用

说明书

本发明涉及了栀子中催化西红花酸生成西红花苷的两个糖基转移酶UGTs(GjUGT94E13和GjUGT74F8)、及其二者的编码基因与功能。属于基因工程技术领域。本发明公开了栀子糖基转移酶GjUGT94E13和GjUGT74F8基因的开放阅读框序列以及其编码的氨基酸序列。本发明基于栀子基因组和转录组数据筛选获得GjUGT94E13和GjUGT74F8基因，通过构建pET32a‑UGTs原核表达载体，以西红花酸为底物在体外验证GjUGT94E13和GjUGT74F8的糖基化功能。结果证明GjUGT94E13和GjUGT74F8具有催化西红花酸生成西红花苷的功能，为具有重要药用价值的西红花苷的合成生物学研究奠定基础。

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及栀子中西红花酸合成至西红花苷生物合成途径中糖基转移酶的筛选、鉴定及应用。

背景技术

西红花酸与葡萄糖基结合形成西红花苷，根据其糖基数目的不同将其分为西红花苷I、西红花苷II、西红花苷III、西红花苷IV、西红花苷V，总称为西红花苷。西红花苷最初是从鸢尾科西红花的柱头中提取出来的，具有广泛的应用价值。现代药理学研究证明其具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗糖尿病等作用，尤其是在中枢神经系统以及心脑血管系统疾病方面作用显著。西红花苷也是一种水溶性的食用色素。由于西红花柱头采收困难且成本高，限制了西红花苷的发展与应用。

茜草科栀子果实中也富含西红花苷，与西红花相比，栀子具有资源丰富、易于取材等特点，被认为是西红花苷理想的替代资源。西红花苷的生物合成途径研究在国际上备受关注，本研究旨在揭示栀子中西红花苷的生物合成途径，研究发现两个糖基转移酶(GjUGT94E13和GjUGT74F8)能够催化西红花酸合成西红花苷产物，为西红花苷的体外合成及大规模应用奠定基础。

发明内容

本发明的目的在于提供两个参与西红花酸合成至西红花苷的糖基转移酶基因及其编码的蛋白质。

本发明的另一目的在于提供一种栀子中西红花苷合成关键酶基因的筛选方法。本发明的第三个目的在于提供对上述筛选出的关键酶基因GjUGT94E13和GjUGT74F8的功能验证方法。

本发明提供的GjUGT94E13和GjUGT74F8基因，其核苷酸序列为SEQ ID No.1和SEQID No.2所示，或其突变序列。

本发明提供的GjUGT94E13和GjUGT74F8基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQID No.3和SEQ ID No.4所示，或其突变序列。

本发明目的可通过如下技术方案实现，技术方案一：基于转录组的栀子西红花苷合成关键酶基因筛选，步骤如下：

1)UPLC检测栀子根、茎、叶、花、幼果、绿果和红果中西红花苷I和II的含量差异。

2)基于栀子基因组，鉴定栀子糖基转移酶UGTs基因家族成员，构建进化树分析栀子与其他物种UGTs之间的进化关系，初筛栀子西红花苷生物合成途径中催化西红花酸至西红花苷的关键酶蛋白序列。

3)基于栀子不同组织部位转录组数据，分析差异基因表达，进一步筛选栀子西红花苷生物合成途径中催化西红花酸至西红花苷的关键酶基因。

技术方案二：关键酶基因GjUGT94E13和GjUGT74F8的功能验证。采用原核表达体系，以西红花酸为底物，体外鉴定糖基转移酶GjUGT94E13和GjUGT74F8的功能。

本发明公开了栀子中西红花酸合成至西红花苷的糖基转移酶编码基因GjUGT94E13和GjUGT74F8的筛选及功能鉴定方法，验证GjUGT94E13和GjUGT74F8具有催化西红花酸至西红花苷的功能，对阐明西红花苷生物合成途径提供分子基础，同时具有重大的应用价值。

附图说明

图1：栀子不同组织器官中西红花苷I和西红花苷II的UPLC检测。