[发明专利]高分子量丝素蛋白链段的制备方法

说明书

本发明公开了一种高分子量丝素蛋白多肽链段的制备方法，采用蚕茧壳脱胶溶解后，加入还原剂还原丝素蛋白中半胱氨酸，将丝素蛋白中的H链（390kDa）和L链（25kDa）之间的二硫键打开，并且在氮气保护的还原性环境下，采用半透膜分离方法，透析去除低分子量部分的丝素蛋白多肽链，获得丝素蛋白中的H链成分。本发明的这种方法分离效率高，不会影响丝素蛋白多肽的生物活性，丝素蛋白中的H链成分，免疫原性低，可用于作为生物医用材料，具有巨大的市场前景和发展潜能。

技术领域

本发明涉及蛋白提纯领域，特别地，是一种高分子量丝素蛋白链段萃取和制备的有效方法。

背景技术

丝素蛋白是一种亚单元结构，在构成上包括一条名为H链(390kDa)的长链，一条名为L链(25kDa)的短链和糖蛋白链P25（30kDa），其中H链依靠二硫键与L链相连。依靠疏水作用，每6个H-L链的集合与一个P25糖蛋白组合形成一个基本单元，比例为H:L:P25 = 6:6:1。在组成上包括18种氨基酸，其中以甘氨酸，丙氨酸，丝氨酸为主，约占总含量的80%。丝素蛋白作为一种天然高分子材料，具有非常优异的性能。例如丝素蛋白具有良好的生物相容性、生物降解性、良好的力学性能等，可以被广泛应用于培养细胞，在组织工程中，用以维持具有预制形状的新生组织的力学形态。丝素蛋白的三条多肽链中，H链疏水性较强，容易形成β-折叠结构，结晶性较强；而其他两条多肽链则亲水性较强，容易形成水凝胶。如果能够分离这两种多肽，获得小分子量多肽部分，则能够获得亲水性丝素蛋白多肽链，用于制备亲水性材料。

目前对于丝素蛋白不同链段的分离的报道较少。方法大致为：（1）改变脱胶方法：增加Na₂CO₃的用量，打断丝素蛋白分子链段之间分子作用力（2）溶解方法CaCl₂-乙醇三元溶液体系溶解，酸、碱、酶水解；（3）层析分离技术：使用不同分子量的葡聚糖分子筛对目的蛋白进行筛选；以上方法虽然具有一定的可行性，但是局限性也比较大。例如：1、改变脱胶工艺和溶解方式的方法，其已经将丝素蛋白分子链段打散，也就是说H链段、L链段和P25链段已经断裂开来，变得不再完整，分子量分布较宽，没有进行真正意义上的分离纯化，所得到的不同分子量链段，也无法知晓其原属于哪一段分子链。2、采用凝胶层析过滤的方法，对于实验员操作水平要求高，葡聚糖凝胶分子筛容易堵塞，产量低，分离效率慢，再者说，如果不将半胱氨酸形成的二硫键断裂开，丝素蛋白中的重链和轻链不会分开，在层析过程中就不会产生速度差，也就导致重链会连接轻链一起层析出来，不会达到真正意义上的分离。

在本发明之前，许多研究人员都是增大Na₂CO₃的用量或者使用CaCL₂-乙醇三元溶液体系将丝素蛋白打散，获得分子量分布宽连续的混合溶液，在对溶液进行分离，极大地破坏了丝素蛋白分子链段的完整性。例如：颜若曦等人《一种中分子量水溶性丝素蛋白的制备》，利用CaCL₂-乙醇-水体系对丝素蛋白降解，再通过凝胶过滤层析方法来获得50 kDa左右的丝素蛋白分子链段，由于CaCL₂-乙醇-水体系溶解过程中，丝素分子链段已被打散，再使用层析柱的方法获得50 kDa左右的丝素蛋白分子，此方法已完全破坏丝素蛋白分子链的完整性。公开号为CN107722116A中国发明专利提供了一种小分子量的丝素肽的分离方法，采用多种类别的葡聚糖分子筛，建立分子筛柱对丝素多肽进行梯度分离，但此方法操作步骤繁琐，对于操作人员要求高，难以获得完整的高分子量丝素蛋白。

发明内容

针对上述存在的不足，本发明的目的提供一种高分子量丝素蛋白链段的制备方法，能够保证丝素蛋白高分子链段的完整性且可以快速大批量获得高分子量丝素蛋白，效率高，产量大。

为了实现上述发明的目的，本发明采用如下技术方案：

一种高分子量丝素蛋白多肽链段的制备方法，包括以下步骤：