[发明专利]一种用于美容保养的脂肪干细胞液的制备方法

权利要求书

1.一种用于美容保养的脂肪干细胞液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一，获取脂肪干细胞，获取脂肪组织，用D-Hanks缓冲液清洗，去除残留的血液和组织碎片，将脂肪组织剪成小脂肪块，把脂肪组织加入消化液，放入37℃恒温震荡箱中消化20min～60min，然后静置待其分层后，吸取上层脂肪细胞液，移入含有胎牛血清的DMEM培养基中，密封离心分离，去除上清液，再次加入适量含有胎牛血清的DMEM培养基，吹打细胞制成脂肪干细胞悬液，接种到培养瓶中，在37℃温度条件下，5％CO₂恒温培养，定期更换培养基直到脂肪干细胞铺满培养瓶底部；

步骤二，传代培养，将步骤一得到的脂肪干细胞从培养基中取出，加入D-Hanks缓冲液清洗干净，然后加入酶液消化处理，在脂肪干细胞长到80％～90％融合后传代培养；

步骤三，低温冷冻，将步骤二取出的脂肪干细胞用D-Hanks缓冲液清洗，加入酶液消化1min～3min，按照脂肪干细胞、DMEM培养液、低温保护剂三者的体积百分比2～4:2～4:1进行混合，先缓慢降至0℃后放入低温冷冻装置中冷冻储存制作冷冻干细胞液；

步骤四，脂肪干细胞液的制备，将步骤三的混合液从低温冷冻装置中取出，放入37℃恒温水浴中解冻，解冻过程中缓慢加入细胞生长因子和D-Hanks缓冲液，制成脂肪干细胞液。

2.如权利要求1所述的一种用于美容保养的脂肪干细胞液的制备方法，其特征在于，在步骤一中，消化液为胰酶和Ⅰ型胶原酶按照体积比1:1混合而成，其中胰酶的质量分数为0.25％，Ⅰ型胶原酶的质量分数为0.1％。

3.如权利要求1所述的一种用于美容保养的脂肪干细胞液的制备方法，其特征在于，在步骤一中，离心分离的速度为800rpm～1800rpm，离心时间为5min～15min。

4.如权利要求1所述的一种用于美容保养的脂肪干细胞液的制备方法，其特征在于，在步骤二中，酶液为质量分数为0.25％的胰酶。

5.如权利要求1所述的一种用于美容保养的脂肪干细胞液的制备方法，其特征在于，在步骤二中，脂肪干细胞生长的代数为四代或六代。

6.如权利要求1所述的一种用于美容保养的脂肪干细胞液的制备方法，其特征在于，在步骤三中，低温保护剂为甘油。

7.如权利要求1所述的一种用于美容保养的脂肪干细胞液的制备方法，其特征在于，在步骤三中，低温冷冻装置的冷冻温度为-40℃～-80℃。

8.如权利要求1所述的一种用于美容保养的脂肪干细胞液的制备方法，其特征在于，在步骤四中，细胞生长因子包括表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、角质细胞生长因子、神经生长因子、肝细胞生长因子、转化生长因子-α、血管内皮细胞生长因子中的一种或多种。

9.如权利要求8所述的一种用于美容保养的脂肪干细胞液的制备方法，其特征在于，在步骤四中，细胞生长因子首先与D-Hanks缓冲液混合。

10.如权利要求9所述的一种用于美容保养的脂肪干细胞液的制备方法，其特征在于，在步骤四中，细胞生长因子与D-Hanks缓冲液的加入量为：每500ml冷冻干细胞液中加入细胞因子5mg～20mg和D-Hanks缓冲液500ml～1000ml。