[发明专利]一种高密度发酵提高PQQ产率的方法

权利要求书

1.一种高密度发酵提高PQQ产率的方法，其特征在于，所述高密度发酵提高PQQ产率的方法包括以下步骤：

(1)菌种活化：将生丝微菌菌种接入斜面培养基，培养后得到成熟斜面菌种；

(2)种母液的制备：取步骤(1)制备的成熟斜面菌种接种于种子培养基中，摇床培养，得到种母液；

(3)种子罐培养：采用1.5-2m³种子罐，加入纯净水至种子罐体积的50-60％，计算所需种子罐培养料边搅拌边加入除无水甲醇外的所有种子罐培养料，待原料完全溶解和分散均匀后用纯净水定容到种子罐体积的60-65％，混合均匀，调节pH至7.0，种子罐灭菌后冷却至25-35℃，加入经无菌过滤的无水甲醇，混合均匀，把步骤(2)中得到的种母液接入种子罐内，控制罐压0.08-0.10MPa，罐温30-35℃，空气流量0.8-1.0VVM，pH为6.8-7.0，通风搅拌培养42-50小时，形成种子罐培养菌液；

每1.5m³的种子罐加入的所述种子罐培养料包括以下重量的原料：

(4)发酵罐初始配制：采用20m³以上发酵罐，加入纯净水至发酵罐体积的30-40％，边搅拌边加入发酵罐培养料，待原料完全溶解和分散均匀后用纯净水定容到发酵罐体积的40-50％，混合均匀，调节pH至7.0，发酵罐灭菌后冷却至25-35℃，按10-20％接种比例，用无菌空气把步骤(3)得到的种子罐培养菌液从种子罐压入发酵罐，控制发酵罐初始压力0.08-0.10MPa，初始流量0.8-1VVM，初始搅拌速度110-130rpm/min，初始温度30℃；

每20m³发酵罐加入的所述发酵罐培养料包括以下重量的原料：

(5)发酵培养并补料：发酵前，在补料罐中加入纯净水和甘油，灭菌后加入经无菌过滤的无水甲醇，混合均匀形成补料；发酵过程中，当发酵罐内甲醇的浓度降到1000-1500ppm时，开始补料，使发酵罐内甲醇和甘油总的浓度始终保持为1000-1500ppm，边补料边发酵培养5-6天，得到PPQ的高含量发酵液。

2.根据权利要求1所述的高密度发酵提高PQQ产率的方法，其特征在于，步骤(3)中和步骤(4)中，均采用无菌过滤后的25％氨水调节pH。

3.根据权利要求1所述的高密度发酵提高PQQ产率的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述种子罐灭菌具体为在总蒸汽压力大于0.3MPa情况下进汽实罐灭菌，控制温度121-125℃，压力0.10-0.12MPa，时间35-50min。

4.根据权利要求1所述的高密度发酵提高PQQ产率的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述发酵罐灭菌具体为采用总蒸汽压力大于0.4MPa情况下进汽实罐灭菌，控制温度121-125℃，压力0.10-0.12MPa，时间30-45min。

5.根据权利要求1所述的高密度发酵提高PQQ产率的方法，其特征在于，步骤(5)中，发酵过程中，培养温度为32-34℃，调节pH为6.5-7.0，控制罐压为0.08-0.20MPa，搅拌转速为110-200rpm/min，控制溶氧值不低于30％。

6.根据权利要求5所述的高密度发酵提高PQQ产率的方法，其特征在于，调节pH具体为：对数生长期间调节pH为6.8，产抗期调节pH为7.0。

7.根据权利要求1所述的高密度发酵提高PQQ产率的方法，其特征在于，步骤(5)中，补料罐中无水甲醇和甘油的体积比为18-20:5-3。

8.根据权利要求1所述的高密度发酵提高PQQ产率的方法，其特征在于，步骤(5)中，发酵过程中，补料速率为每小时30-50升。

9.根据权利要求1所述的高密度发酵提高PQQ产率的方法，其特征在于，步骤(5)中，发酵过程中，加入消泡剂，对液面泡沫进行控制，防止跑液。

10.根据权利要求1所述的高密度发酵提高PQQ产率的方法，其特征在于，步骤(5)中，发酵过程中，控制溶氧值具体为：通过调节罐压、通风量、通入空气中的氧气含量和搅拌转速，确保发酵全程内溶氧值不低于30％。