[发明专利]一种快速诱导藜麦毛状根的方法

说明书

本发明公开了一种快速诱导藜麦毛状根的方法，包括下述步骤：1)构建含有GUS基因的发根农杆菌A4；2)藜麦外植体侵染；无菌藜麦外植体用浸染液A或侵染液B侵染，浸染液A由野生型发根农杆菌A4制备获得，侵染液B由步骤1)含有GUS基因的发根农杆菌A4制备获得；3)侵染后的藜麦外植体进行共培养；4)共培养后的藜麦外植体移至诱导培养基中培养，获得藜麦毛状根；5)藜麦毛状根进行继代和扩增培养；6)对藜麦毛状根进行GUS染色，藜麦毛状根为由侵染液B浸染后的藜麦外植体经步骤3)、4)、5)培养获得。本发明能够快速高效的诱导多藜麦毛状根的生长，同时可简便、直观、快速的检测毛状根的转化效率。

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，具体为一种快速诱导藜麦毛状根的方法。

背景技术

藜麦是苋科藜亚科藜属一年生双子叶草本植物，起源于南美洲安第斯山脉，原产地主要在秘鲁、玻利维亚及厄瓜多尔，由于其丰富的营养价值和独特的功能特性，被印第安人称为“粮食之母”。藜麦含有大量的优质蛋白质，并且其氨基酸组成均衡，联合国粮农组织(FAO)已正式推荐其为最适宜人类的完美“全营养食品”，称其为可满足人类基本食物需求的唯一单体植物。在进行藜麦的基因功能验证的方法中，一般采用拟南芥或者诱导愈伤再生，生长周期比较长而且转化效率比较低。而毛状根具有生长周期短，便于培养，易于转化、转化率高等优点，但目前现有技术中还没有构建出快速诱导藜麦毛状根的方法。而且现有针对毛状根诱导的检测，常用高压纸电泳法进行冠瘿碱的检测，用硝酸银试剂或磷钼酸试剂染色，但上述检测方法存在操作复杂，耗时费力的问题。

发明内容

本发明提供一种快速诱导藜麦毛状根的方法、能够快速高效的诱导藜麦毛状根的生长，同时可简便、直观、快速的检测毛状根的转化效率。

为解决上述问题，本发明提供一种快速诱导藜麦毛状根的方法，包括下述步骤：

1)构建含有GUS基因的发根农杆菌A4；

2)藜麦外植体侵染；

无菌藜麦外植体用浸染液A或侵染液B侵染，浸染液A由野生型发根农杆菌A4制备获得，侵染液B由步骤1)含有GUS基因的发根农杆菌A4制备获得；

3)侵染后的藜麦外植体进行共培养；

4)共培养后的藜麦外植体移至诱导培养基中培养，获得藜麦毛状根；

5)藜麦毛状根进行继代和扩增培养；

6)对藜麦毛状根进行GUS染色，所述藜麦毛状根为由侵染液B浸染后的藜麦外植体经步骤3)、4)、5)培养获得。

优选的，步骤1)具体为：含有GUS基因的pCR3301质粒加入发根农杆菌A4感受态中，依次经冰上孵育、液氮速冻、金属浴热激后转入第一YEB液体培养基培养，获得的培养物离心移去上清液，剩余沉淀移入YEB固体培养基培养，获得单克隆菌，所述单克隆菌移入第二YEB液体培养基中震摇，获得菌液，菌液经PCR检测筛选，获得含有GUS基因的发根农杆菌A4。

优选的，步骤1)YEB固体培养基为含100mg/L Kan(卡那霉素)和100mg/L Rif(利福平)的培养基。

优选的，步骤1)第二YEB液体培养基为含100mg/L Kan(卡那霉素)和100mg/L Rif(利福平)的培养基。

优选的，步骤2)中无菌藜麦外植体为3天到2周龄的无菌藜麦外植体。

优选的，步骤2)中侵染时间为8-15分钟。

优选的，步骤2)侵染液A的制备方法为：选取OD值(600)为0.6-1.0发根农杆菌A4进行离心，离心得到的固体用0.5-2.0倍体积MS液体培养基重悬获得。