[发明专利]基于倏逝波照明的三维活细胞超分辨显微成像方法和装置

说明书

本发明公开了一种基于倏逝波照明的三维活细胞超分辨显微成像方法和装置，属于光学超分辨显微成像领域，包括：以大于全反射临界角的入射光单角度入射样品，获取一系列横向超分辨重构原始图像，对所有横向超分辨原始图像进行重构，得到样品的横向超分辨图像；以大于全反射临界角的入射光在任意两个入射角度下入射照明样品，同时进行环形扫描，获取相应的两张轴向超分辨重构原始图像；对轴向超分辨重构原始图像进行减背景预处理，同时以单张轴向重构原始图像和横向超分辨图像为模板分别进行信息提取，并对提取后的图像分别进行轴向超分辨重构和三维超分辨重构，得到轴向超分辨图像和三维超分辨图像。

技术领域

本发明涉及光学超分辨显微成像领域，具体地说，涉及一种基于倏逝波照明的三维活细胞超分辨显微成像方法和装置。

背景技术

观察和研究细胞结构及功能是生物学分支学科。细胞是组成有机体的形态和功能的基本单位，自身又是由许多部分构成的。关于结构的研究不仅要知道它是由哪些部分构成的，而且要进一步搞清每个部分的组成。相应地，关于功能不仅要知道细胞作为一个整体的功能，而且要了解各个部分在功能上的相互关系。长期以来，受到光学衍射极限的限制，传统的光学显微镜无法分辨200nm横向范围和600nm轴向范围内的物体细节信息，这严重限制了光学显微镜在生物学等领域的发展和应用。

为了解决这一问题，科学家们提出了一系列的超分辨显微成像技术打破了衍射极限，从而实现了对组织结构的纳米级别观察。作为代表性的一种技术，结构光照明显微镜使用两束光在待测样品表面相互干渉产生摩尔条纹，调制样品的空间频率，将通常不可见的高频信息移动到可观测到的低频范围内，相当于将光学传递函数的截止频率提高了两倍，实现了超分辨成像。超分辨荧光显微成像技术的发展大力推动了相关应用领域的发展，将光学显微镜推动到新的高度。

但是，对活细胞进行快速三维超分辨成像、观察精细结构的三维运动对生物学研究来说至关重要。目前三维活细胞超分辨成像仍然面临诸多问题，其中最重要的两个问题：一是如何实现三维超分辨成像，观察细胞的精细结构；二是如何在不牺牲空间分辨率的前提下，提高时间分辨率，追踪细胞的实时运动。

作为生物样品成像最快的技术之一，全内反射荧光显微镜形成的照明倏逝波呈轴向指数衰减，从而只对薄层样品进行照明，具有很高的信噪比和轴向分辨率，目前已被广泛应用于观察与细胞膜结构有关的动态过程。通过进一步改变照明光束的入射角，从而改变倏逝波的穿透深度，可以建立起照明光场与获取图像之间的对应关系，进一步通过逆问题求解能够定量重建样品的轴向超分辨分布，这被称为多角度全内反射荧光显微镜。但该方法需要获取数十张原始图像才能得到数十纳米的轴向分辨率，这在一定程度上丢失了全内反射荧光显微镜的最大优点，限制了它在活细胞实时成像中的应用。

另一方面，全内反射荧光显微镜只是提高了系统的轴向分辨率，其横向分辨率仍然受到衍射极限的限制，难以突破半波长量级，无法用于观察样品的三维精细结构。

发明内容

本发明的目的为提供一种基于倏逝波照明的三维活细胞超分辨显微成像方法，可同时提高系统的轴向分辨率和横向分辨率，并实现三维实时多色超分辨显微成像。

本发明的另一目的为提供基于倏逝波照明的三维活细胞超分辨显微成像装置，该装置可用于实现上述三维活细胞超分辨显微成像方法。

为了实现上述目的，本发明提供的基于倏逝波照明的三维活细胞超分辨显微成像方法包括：

以大于全反射临界角的入射光单角度入射样品，获取一系列横向超分辨重构原始图像，对所有横向超分辨原始图像进行重构，得到样品的横向超分辨图像；

以大于全反射临界角的入射光在任意两个入射角度下入射照明样品，同时进行环形扫描，获取相应的两张轴向超分辨重构原始图像；