[发明专利]一种基因多态性位点检测技术及其试剂盒

说明书

本发明提供了一种利用错配探针检测基因多态性位点的方法。在基于重组酶聚合酶扩增反应体系中,通过添加一条或两条特异性错配探针,根据探针与模板间的错配对酶切效率的影响,这一特征可通过探针上的荧光信号区分基因多态性位点，在疾病检测等领域具有重要的应用价值。所述错配探针以基因分型位点为1号位点，在探针上游（5’方向）的2‑4号位点人为引入至少一个与待检序列错配的碱基，错配位点能够增加探针在检测基因单核苷酸多态性中的特异性。本发明还提供了用于检测单核苷酸多态性的特异性探针、引物以及基于重组酶聚合酶扩增的检测试剂盒成分。

技术领域

本发明属于生物医学领域，通过检测核酸中碱基的多态性位点，进行基因型分析，或者进行遗传病或传染病诊断等应用。

背景技术

SNP(single nucleotide polymorphism)是基因组中单个核苷酸碱基的突变、颠换、插入和缺失等引起的单核苷酸多态性。SNP被广泛地应用于分子遗传学、法医学和疾病诊断等众多领域。人类基因组计划的实施，使我们发现人类基因组中存在大量的SNP位点，占比超过人类基因组DNA碱基数的1％，平均约1000bp会出现一个SNP[1]，其中一些SNP会导致遗传疾病，包括癌症，糖尿病，镰刀型贫血症，帕金森病，阿尔茨海默症，自身免疫性疾病等等。引起传染病的病原，如病毒，细菌，寄生虫等病原体也存在大量的SNP位点，针对它们的SNP 检测可以进行传染病诊断，病原基因型鉴定等。

针对SNP检测越来越得到人们的重视，关于SNP的检测技术也得到了快速发展。传统的 SNP检测方法大多需要进行凝胶电泳，以判断检测结果，它们主要有：变性梯度凝胶电泳 (DGGE)，单链构象多态性(SSCP)，限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)。这些方法由于自身局限性操作均非常繁杂。Suzuki等在1991年提出了一种基于PCR检测SNP位点的方法——等位基因特异性PCR(AS-PCR)[2].该方法的原理是基于PCR反应中DNA聚合酶对于引物 3’末端的单个碱基错配无法修复延伸，导致扩增无法进行，一般情况下只有当引物3’端最后一个碱基与模板链互补时，扩增反应才能进行。在实际应用当中，有时即使3’最末端的碱基与DNA模板发生错配，扩增反应仍然可以进行[3]。后来，为了解决这一问题，Hayashi等人在2004年提出，人为再将3’末端倒数第二或第三个碱基替换成与模板链错配的碱基能够解决这一问题，这样显著的提高了引物检测SNP位点的特异性[4]。目前，基于AS-PCR已经延伸出多种改良方法，如四引物扩增受阻突变体系PCR(tetra-primer amplificationrefractory mutation system PCR,Tetra-primer ARMS-PCR)[5]、片段长度差异等位基因特异PCR(fragment length discrepant allele specific PCR,FLDAS-PCR)[6]、多等位基因特异扩增(PCR amplification of multiple specific alleles,PMASA)[7]等。这些方法也已经应用到了生命科学的各个领域。AS-PCR 较前面提到的方法更简便、快速、可以对SNP分型、费用较低等优点。但是，该方法在设计时需要优化反应条件，对扩增条件要求比较严格。为了使检测更加便捷，通常在反应中添加 DNA双链嵌入染料或特异性荧光探针，并采用实时荧光定量PCR仪实时监测扩增反应。而实时荧光定量PCR仪因为其精密的控温元件和光学元件，价格昂贵，无法普及至基层医院或非实验室环境应用，这些因素都制约着AS-PCR的进一步广泛应用。

随着分子生物学技术的发展出现了多种高通量、自动化的SNP检测方法，主要有直接测序、DNA芯片、变性高效液相色谱(DHPLC)、质谱检测技术、高分辨率溶解曲线(HRM)等，与基于凝胶电泳的SNP检测方法相比，该类方法能实现SNP高通量、自动化检测，但对设备和技术要求高，成本很高，一般的医院和实验室都不具备这些技术。近些年来出现了等温核酸扩增技术，基于这些技术建立的SNP检测方法，无需昂贵的仪器设备，可以在不发达地区实现SNP快速检测，这些特点使得基于等温核酸扩增的SNP检测技术具有广阔的应用前景。