[发明专利]陈旧血痕miRNA高通量测序文库的构建方法

权利要求书

1.陈旧血痕miRNA高通量测序文库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、陈旧血痕样品的预处理；

B、miRNA的提取；

C、miRNA测序文库的构建，步骤如下：

C1、miRNA 5’和3’接头的连接；

C2、反转录；

C3、PCR扩增；

C4、PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收145-160bp大小的片段，即得测序文库；

步骤A预处理的具体方法为：取5cm²陈旧血痕样品，剪碎至3-5mm²，加入200-400μl裂解液，室温静置10min，然后振荡器振荡混匀30sec；

步骤B进行miRNA提取的具体方法为：

B1、经预处理后的样品室温放置5min，然后室温12000rpm离心10min，取上清，转入一个新的无RNase的离心管中；

B2、加入200-400μl氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15sec，室温放置5min；然后室温12000rpm离心15min，样品分层，将无色的水相转移至新管中；

B3、量取转移液的体积，缓慢加入转移液体积1/3体积的无水乙醇，混匀后转入吸附柱miRspin，室温放置2min后，室温12000rpm离心30sec，收集流出液；

B4、量取流出液的体积，缓慢加入流出液体积2/3体积的无水乙醇，混匀后转入吸附柱miRelute，室温放置2min后，室温12000rpm离心30sec，离心后弃流出液，保留吸附柱miRelute；

B5、向吸附柱miRelute中加入500-1000μl去蛋白液，室温静置2min后，室温12000rpm离心30sec，弃流出液；

B6、向吸附柱miRelute中加入500-1000μl漂洗液，室温静置2min后，室温12000rpm离心30sec，弃流出液；

B7、重复操作步骤B6；

B8、将吸附柱miRelute放入收集管中，室温12000rpm离心1min，去除残液；

B9、向吸附柱miRelute中加入20-40μl RNAase free水，静置15min，加入新离心管中，室温12000rpm离心5min，收集流出液进行RNA浓度检测后直接用于文库构建或于-80℃保存；

步骤C1具体方法如下：

C1a、连接3’接头

①配制如下反应体系：

RNA 3’Adapter 1μl

总RNA 5μl

其中，总RNA起始量为10ng；

上述体系充分混匀；70℃孵育2min，然后立即置于冰上；

②在一个新的PCR管中配制如下反应体系：

Ligation Buffer 2μl

RNase Inhibitor 1μl

T4 RNA Ligase2 1μl

③将步骤②的体系与步骤①得到的体系充分混合，28℃孵育1h；向混合体系中加入1μlStop Solution，混匀；继续于28℃孵育15min，然后立即置于冰上，得到3’接头连接产物；

C1b、连接5’接头

④将1.1μl RNA 5’Adapter加至一个新的PCR管中，70℃孵育2min，然后立即置于冰上；向管中加10mM ATP 1.1μl，充分混匀；再加入1.1μl T4 RNA Ligase，充分混匀；将3μl上述混合液加入装有11μl 3’接头连接产物的PCR管中，充分混匀，然后于28℃孵育1h，然后置于冰上，得到5’和3’接头连接产物；

步骤C2进行反转录的具体方法为：

C2a、将5’和3’接头连接产物浓缩至6μl，向其中加入1μl RNA RT Primer，充分混匀后短暂离心；70℃孵育2min，然后立即置于冰上；

C2b、在一个新的PCR管中，冰上配制如下反应体系：

上述体系充分混匀后短暂离心；

将步骤C2b所得体系加入C2a的混合液中制备好的样品中，于50℃孵育1h，然后立即置于冰上；

步骤C3进行PCR扩增的具体方法为：

制备如下预混液：

上述预混液充分混匀后短暂离心，将制备的预混液加入装有步骤C2所得反转录溶液的PCR管中，按照如下条件进行PCR扩增：98℃30sec；98℃10sec，60℃30sec，72℃15sec，15个循环；72℃10min；

步骤C4的具体方法如下：

C4a、PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收145-160bp大小的片段；

C4b、溶胶

⑤将切下的胶块0.01克放入自制的gel breaker tube管中，再将自制的gel breakertube管放入将含有200μl溶胶液的2ml离心管中，20000g离心2min；将200ml枪头剪去尖端部位，吸取2ml离心管中液体转移至含有300μl超纯水的2ml离心管中；以40转/分速度置于摇床上室温摇匀过夜；

其中，所述自制的gel breaker tube离心管是用针头将0.5ml离心管底部扎10个孔，各孔孔径为0.2mm；

所述溶胶液的制备方法为：取54g Tris碱，27.5g硼酸，20ml 0.5mol/L pH8.0 EDTA，加蒸馏水至1000ml，得到储液，使用时将储液稀释10倍即为溶胶液；

⑥将过夜溶解后的胶块转移至孔径为5μm的滤管，室温600g离心30sec，然后向其中加入2μl Glycogen，30μl 3M醋酸钠，975μl预冷无水乙醇，充分混匀，4℃，20000g离心20min，弃上清，向沉淀中加入500μl 70％酒精洗涤，室温20000g离心2min，弃上清，开盖晾干沉淀，用10μl 10mM Tris-HCl溶解沉淀，所得文库经过质检，用于Illumina Hiseq 2000或FGx高通量测序；

步骤A中使用的裂解液为MZ，步骤B中使用的去蛋白液为MRD，漂洗液为RW，步骤B中使用的吸附柱miRspin、吸附柱miRelute，上述试剂及柱均来自于天根miRNA提取试剂盒；

步骤C中使用的RNA 3’Adapter为RA3，Ligation Buffer为HML，T4 RNA Ligase2，StopSolution为STP，5’Adapter为RA5，T4 RNA Ligase，First strand buffer，PCR mix为PML，RNA PCR Primer为RP1，RNA PCR Primer Index为RPIX，上述试剂均来自于Illumina miRNA文库构建试剂盒。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述5cm²陈旧血痕样品中含有的RNA总量为10ng-100ng。