[发明专利]一株生产肝素酶的大肠埃希氏菌及其构建方法和应用

说明书

本发明提供了一株生产肝素酶的大肠埃希氏菌Escherichia coli BLR(DE3)‑pBENT‑H1，属于基因工程菌的构建的技术领域，保藏编号为CGMCC No.15819。本发明提供的生产肝素酶的大肠埃希氏菌能够生产肝素酶，肝素酶的酶活为2540U/L，将得到的肝素酶酶解肝素，得到的超低分子量肝素的重均分子量为1419Da，低分子量肝素的Anti‑FXa/Anti‑FIIa效价比值为28.4。

技术领域

本发明属于基因工程菌的构建的技术领域，具体涉及一株生产肝素酶的大肠埃希氏菌及其构建方法和应用。

背景技术

肝素及其结构类似物硫酸乙酰肝素是一类由硫酸化葡糖胺和己糖醛酸组成的长链多糖，属于粘多糖中的一种。从1935年以来，肝素和硫酸乙酰肝素正式用作临床抗凝药物，成为仅次于胰岛素的第二大类天然产物药物，全球年产值达100亿美元，广泛用于治疗血栓塞、暴发性流脑、败血症、肾炎、急性心肌梗塞、动脉硬化等疾病。然而，临床应用表明，在肝素治疗中常伴随着很多不同的副作用，例如出血、肝素诱导性血小板减少症、过敏反应等。为了避免利用普通肝素带来的副作用，有学者提出了低分子量肝素的概念。低分子量肝素是由普通肝素(相对分子量在3000-30000)通过化学裂解法或肝素酶裂解法解聚得到的一类相对分子量在3000-8000的肝素的总称，包括伊诺肝素，达肝素钠，亭扎肝素等。因临床应用证明低分子量肝素在引起血小板减少、骨质疏松、出血等副作用方面优于普通肝素，当前低分子量肝素已取代大部分普通肝素的市场。而现阶段正在进行第三代创新型药物-超低分子量肝素的研发。超低分子量肝素的平均相对分子量小于2500，Anti-FXa/Anti-FIIa效价更高，抗凝血活性优于低分子量肝素，出血和血小板减少症等副作用更小，所以其研究与制备受到越来越多的关注。

目前已报道的几种超低分子肝素均为化学方法制备，该法处理效果过于激烈容易导致某些基团损坏从而失去生物活性，使得制备的肝素具有多分散性、微观非均相和结构变异大等缺点。相比之下，肝素酶裂解法的反应条件更加温和且环境友好，生成的不饱和糖醛酸的分子量与232nm处的紫外吸收有一定关系，便于检测，产物中不会引入有毒物质，产物硫酸化程度较高，不会作用于硫酸基团，且产物和肝素酶易于分离，生产中十分方便，易实现生产的连续化。同时，酶可反复使用，可极大的节约成本，是较理想的工业化生产途径。然而根据现状来看，虽然我国是肝素原料的出口大国，但是肝素类药物的生产技术一直缺乏系统的研究，目前我国肝素类药物还需要依靠进口或者来自合资企业生产，因此，肝素类药物的酶法生产研究具有重要的工业应用前景。

但是在过去的十年里报道了许多关于产肝素酶的微生物的研究，一般都是关于肝素黄杆菌产的肝素酶，经过NCBI数据库验证，目前为止，未见利用肝素酶基因构建的重组菌来生产肝素酶。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一株生产肝素酶的大肠埃希氏菌及其构建方法和应用，所述生产肝素酶的大肠埃希氏菌能够使肝素酶的酶活得到提高，且利于后续肝素酶的分离纯化。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一株生产肝素酶的大肠埃希氏菌Escherichia coli BLR(DE3)-pBENT-H1，保藏编号为CGMCC No.15819。

本发明还提供了上述技术方案所述的生产肝素酶的大肠埃希菌的构建方法，包括以下步骤：

1)提取含有肝素酶基因的微生物的全基因组DNA，以全基因组DNA为模版，用肝素酶基因引物对进行PCR扩增，得到肝素酶基因；

所述肝素酶基因引物对包括肝素酶基因上游引物和肝素酶基因下游引物，所述肝素酶基因上游引物具有SEQ ID No.1所示的序列，所述肝素酶基因下游引物具有SEQIDNo.2所示的序列；

2)以质粒pBENT DNA为模版，用质粒引物对进行PCR扩增，得到质粒基因；