[发明专利]适用于qRT-PCR法检测TbAP2a基因表达的引物组合、试剂盒和方法

说明书

本发明公开了一种适用于qRT‑PCR法检测TbAP2a基因转录水平表达的扩增TbAP2a基因组合，包括上游引物和下游引物，上游引物选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:7中的至少一种；下游引物选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8中的至少一种。本发明还公开了包含该引物组合的试剂盒以及使用引物组合或试剂盒扩增TbAP2a基因的方法和对TbAP2a基因表达进行定量的方法。本发明的引物组合灵敏度高、特异性强、扩增效率高，且扩增或定量方法能显著降低污染，操作简便，能快速完成扩增或定量，结果判读简单客观，便于分析。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及用于qRT-PCR法检测TbAP2a基因表达的引物组合、试剂盒和方法。

背景技术

实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,qRT-PCR)技术兴起于上世纪90年代，目前已经被普遍用于分析检测基因转录水平表达。相对于常规半定量RT-PCR而言，qRT-PCR具有实时、特异性强及灵敏度高等优点，已广泛应用于分子生物学、医学和诊断学等诸多研究领域。

qRT-PCR从荧光组分角度上划分常用的主要有两种：DNA结合染料(SYBR Green I)和Taqman探针法。SYBR Green I法相较于后者具有实验简单、成本低等特点，从而更多地被应用于低通量、单重实验。从实验目的角度qRT-PCR技术还可以分为绝对定量和相对定量两种。绝对定量主要通过建立已知量的标准品的标准曲线，并利用未知待测样品量的CT值推算某个基因的绝对数值(拷贝数)。相对定量则主要比较不同组织之间或处理样品与未处理样品中目的基因的表达差异。相对定量数据计算方法主要有2^-ΔΔCT法(Livak法)、2^-ΔCT法和Pfaffl法。2^-ΔΔCT法(Livak法)是检测基因相对表达量数据分析中最为普遍采用的计算方法，但是该方法要求目的基因和内参基因的扩增效率接近100％，否则，倘若两者扩增效率相差较大，就会导致实验结果不能真实反映基因的表达水平，因此必须对实验体系进行优化或者采用Pfaffl法计算。

红豆杉(Taxus L.)为裸子植物，属于红豆杉科，因可以从该树种中提取抗癌药物紫杉醇从而引起国际上的广泛关注。另外，植物中庞大的AP2基因家族成员因其广泛参与植物响应外界环境胁迫、生长发育相关的转录调控而备受重视。然而，目前尚未见到有关这些基因qRT-PCR中相对定量法的最佳反应体系建立及优化的研究。

发明内容

发明人在研究过程中，通过大量创造性的基因克隆与功能研究工作，意外地发现一种参与植物响应外界环境胁迫转录调控的TbAP2a基因，为了检测其在植物中的表达情况，本发明一方面提供了一种用于扩增TbAP2a基因的引物组合，包括上游引物和下游引物，上游引物选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:7中的至少一种；下游引物选自SEQID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8中的至少一种。

在本发明的实施方案中，上游引物选自SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:7中的一种，下游引物选自SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:8中的至少一种。

在本发明的一个具体实施方案中，上游引物是SEQ ID NO:7，下游引物是SEQ IDNO:4。

在本发明中，所述TbAP2a基因为红豆杉科植物的TbAP2a基因，优选为红豆杉的TbAP2a基因。

本发明的第二方面提供一种用于扩增TbAP2a基因的试剂盒，包括本发明第一方面所述的引物组合。