[发明专利]一种提取红麻花药总RNA的方法

说明书

本发明涉及生物化学技术领域，特别是指一种提取红麻花药总RNA的方法。解决了现有技术中红麻花药RNA提取过程易被降解难，产物易被红麻次生代谢物多糖多酚污染的技术问题。本研究用饱和异硫氰酸胍替代氯化钠，采用改良CTAB法提取红麻花药总RNA，本申请的提取方法能有效抑制红麻总RNA降解，提高红麻总RNA纯度和完整性，而且试剂成本低，操作流程简单。

技术领域

本发明涉及生物化学技术领域，特别是指一种提取红麻花药总RNA的方法。

背景技术

红麻是重要的韧皮纤维经济作物，与我国所倡导的低碳社会相适应，其育性对该作物的经济价值影响颇大。它的韧皮部包含近75%的纤维和7%的木质素，在生物降解和环境保护方面有很大的利用价值。红麻具有多种多样的用途包括造纸，建筑材料，地毯，衣服等。随着全球对纤维的需求量的增大，森林资源的短缺，世界各国都在积极寻求新型纤维资源，红麻就成为一种重要的替代资源。随着红麻基因组测序的进行，对红麻基因功能的研究如火如荼；红麻总RNA的提取作为一项最基础的实验，如果RNA的质量不行对后续实验的影响巨大，而红麻花药成分中含有大量的多糖、多酚以及其特有的次生代谢产物，这些物质很容易与RNA结合，在提取RNA的过程中被同时抽提出来，从而阻碍具有生物活性红麻RNA的分离，影响RNA提取的质量；为了将多糖、多酚以及其特有的次生代谢产物在提取过程中去除，现有的RNA提取方法有多种，常规的CTAB提取法采用饱和氯化钠进行沉淀，得到的RNA由于RNA酶没有得到有效抑制，使其容易发生降解，并且多糖去除不彻底，RNA污染严重；采用试剂盒进行提取时，时间虽然相对于常规CTAB法缩短了，但通过试剂盒提取到的红麻花药总RNA中常常被糖类、盐类、蛋白或酚类物质污染，得到的RNA的纯度和完整性较差。

发明内容

本发明提出一种提取红麻花药总RNA的方法，解决了现有技术中红麻花药RNA提取难，产物易被污染的技术问题。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种提取红麻花药总RNA的方法，步骤为：

（1）称取0.2-0.5 g新鲜或经液氮冷冻处理后存放在-80℃冰箱的花药立即置于预先冰冻后的研钵中，加入足量液氮迅速将花药研成粉末，快速将粉末转入RNase-free离心管中；

（2）向离心管中加入1mL 65℃预热的改良CTAB裂解液，涡旋震荡30-60 s，65 ℃，水浴10 min；

（3）加入体积比为25:24:1的水饱和酚、氯仿和异戊醇混合液，充分混匀，4℃，12,000rpm，离心10min，取上清Ⅰ；

（4）以上清Ⅰ体积为基准，按照上清液：异硫氰酸胍=1.7：1的比例加入饱和异硫氰酸胍，再加入0.5倍的无水乙醇，颠倒混匀；

（5）吸取混合液Ⅱ，将混合Ⅱ转移到RNA纯化柱中，冰上静置2 min；

（6）4℃，12000 rpm，处理30 s，弃去RNA纯化柱的收集管内的液体，重复此步骤直至将混合液Ⅱ全部转移完；

（7）向经步骤（6）处理的RNA纯化柱中加入700 μL 75%乙醇，4℃，12000 rpm处理30 s，弃去收集管内的滤液，重复该步骤1次；

（8）将经步骤（7）处理的RNA纯化柱，于4℃，12000 rpm，离心空甩2 min；

（9）将经步骤（8）处理的RNA纯化柱放入新的1.5 ml RNase-free EP管，向RNA纯化柱中央加入30 μl RNase-free ddH₂0，于冰上静置2 min；

（10）将经步骤（9）处理的RNA纯化柱和EP管于4℃，12000 rpm，离心1 min，弃去RNA纯化柱，EP管中收集的液体即为纯化的红麻花药总RNA。