[发明专利]一种外源片段高效定点定向插入DNA病毒基因组的方法

权利要求书

1.一种外源基因片段高效定点定向插入DNA病毒基因组的方法，其特征在于包括下列步骤：

1)设计并构建针对DNA病毒基因组特定切割位点的CRISPR-Cas9系统；

2)设计并构建携带有1个及以上能够被相同CRISPR-Cas9系统识别的定向切割位点和外源基因片段组成的供体系统；

3)将CRISPR-Cas9系统表达载体和外源基因供体按照一定比例和顺序，选择适宜方法导入特定细胞；

4)根据DNA病毒增殖特性，确定优化的感染时间点、感染复数并感染细胞；

5)选择优化的时间点收集病毒感染后产生的子代重组病毒；

6)分离、筛选和鉴定目标重组子代DNA病毒。

2.根据权利要求1所述的一种外源基因片段高效定点定向插入DNA病毒基因组的方法，其特征在于：所述步骤1)具体为：

选择DNA病毒基因组上特定的插入区域或位点，构建能够定点切割病毒基因组特定位点的CRISPR-Cas9核酸酶系统：该系统包含导向功能的分子和具有定点切割双链DNA活性的蛋白核酸酶；

有多个位点可以选择时，可筛选出Cas9蛋白酶对DNA的切割效率较高的位点，筛选的方式可通过Surveyor错配酶等系统对切割效率进行检测和比较。

3.根据权利要求1所述的一种外源基因片段高效定点定向插入DNA病毒基因组的方法，其特征在于：所述步骤2)具体为：在步骤1)中确定了插入位点后，在外源基因的前后两端或者前后任意一端加入与基因组上蛋白酶切割位点反向互补的完整序列；外源基因供体系统的载体形式为质粒形式，或聚合酶链式反应的产物，或微环DNA的形式；CRISPR-Cas9核酸酶系统的形式可以为质粒形式，或RNA形式，或蛋白和RNA复合体形式，或病毒载体的形式。

4.根据权利要求1所述的一种DNA病毒基因组的外源基因非同源定点整合方法，其特征在于：所述步骤3)具体为：转染方法为将转染细胞接种于细胞培养板上培养后再加入DNA和转染试剂的复合物来进行转染，或者将DNA和转染试剂的复合物预先加入到细胞培养板后再接种细胞进行转染，或者使用电导入的方法将DNA导入细胞，此外CRISPR-Cas9核酸酶系统表达质粒和外源基因供体质粒的比例为4:1-1:1之间。

5.根据权利要求1所述的一种DNA病毒基因组的外源基因非同源定点整合方法，其特征在于：所述步骤4)具体为：转染后可感染性病毒颗粒感染细胞的时间点为转染后4-24小时，感染复数为0.01-10之间。

6.根据权利要求1所述的一种DNA病毒基因组的外源基因非同源定点整合方法，其特征在于：所述步骤5)具体为：收集子代DNA病毒的时间为病毒感染细胞后24-72小时。

7.根据权利要求1所述的一种DNA病毒基因组的外源基因非同源定点整合方法，其特征在于：所述步骤6)具体为：将经过上述步骤1)-步骤6)优化后的所获得的子代病毒，通过挑取噬斑、有限稀释法或者流式细胞分选技术来进行子代病毒的分离纯化，分离纯化的子代病毒可进行核酸测序鉴定，扩增保存重组正确的子代病毒；对重组病毒的鉴定也可为但不限定于利用报告基因检测、利用抗性基因筛选、蛋白表达的检测等方式。