[发明专利]用于快速筛选重组菌株的重组表达载体及应用

权利要求书

1.一种用于快速筛选高表达纤维素酶的里氏木霉的重组表达载体，其特征在于，在所述重组表达载体的基因表达盒中由上游到下游依次包括元件：cbh1启动子、红色荧光蛋白基因DsRed、细胞表面蛋白锚定信号肽基因AfMp1及cbh1终止子，其中，DsRed基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，AfMp1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.含有权利要求1所述的用于快速筛选高表达纤维素酶的里氏木霉的重组表达载体的重组里氏木霉。

3.权利要求1所述的用于快速筛选高表达纤维素酶的里氏木霉的重组表达载体的应用。

4.快速筛选重组里氏木霉的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)将含有元件cbh1启动子、红色荧光蛋白基因DsRed、细胞表面蛋白锚定信号肽基因AfMp1及cbh1终止子的基因表达盒导入质粒中，得到重组表达载体，其中，DsRed基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，AfMp1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

(2)用步骤(1)构建的重组表达载体转化宿主细胞，得到重组菌株；

(3)培养重组菌株，诱导红色荧光蛋白表达于重组菌株的表面；

(4)筛选展示红色荧光的重组菌株。

5.根据权利要求4所述的快速筛选重组里氏木霉的方法，其特征在于，在步骤(4)中，用流式细胞仪筛选表面展示红色荧光的重组菌株。

6.快速筛选高表达纤维素酶且高酶活的里氏木霉的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)将含有元件cbh1启动子、红色荧光蛋白基因DsRed、细胞表面蛋白锚定信号肽基因AfMp1及cbh1终止子的基因表达盒导入质粒中，得到重组表达载体，其中，DsRed基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，AfMp1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

(2)用步骤(1)构建的重组表达载体转化宿主细胞，得到重组里氏木霉；

(3)向步骤(2)得到的所述重组里氏木霉中导入蛋白分泌途径相关的基因，或者向步骤(2)得到的重组里氏木霉中随机插入载体或基因，获得重组里氏木霉的突变体库；

(4)用流式细胞仪筛选表面展示强烈红色荧光的重组里氏木霉；

(5)测定步骤(4)中得到的重组里氏木霉的纤维素酶酶活，获得纤维素酶酶活提高的重组里氏木霉。

7.根据权利要求6所述的快速筛选高表达纤维素酶且高酶活的里氏木霉的方法，其特征在于，步骤(3)中，与蛋白分泌途径相关基因包括bip1基因、hac1基因、ftt1基因、sso2基因、sar1基因、ypt1基因。

8.根据权利要求6所述的快速筛选高表达纤维素酶且高酶活的里氏木霉的方法，其特征在于，步骤(3)中，用根瘤农杆菌介导里氏木霉转化，得到里氏木霉突变体库。

9.快速筛选高与提高纤维素酶酶活相关的蛋白分泌途径相关基因的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)构建含有红色荧光蛋白基因和细胞表面蛋白锚定信号肽基因的DsRed-AfMP1融合基因的重组表达载体，其中，DsRed基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，AfMp1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

(2)用步骤(1)构建的重组表达载体转化菌株，得到重组菌株；

(3)向步骤(2)得到的所述重组菌株中导入待筛选的目的基因，或者向步骤(2)得到的重组菌株中随机插入载体或基因，获得重组菌株的突变体库；

(4)用流式细胞仪筛选表面展示红色荧光的重组菌株；

(5)测定步骤(4)中筛选出的表面展示红色荧光的重组菌株的纤维素酶酶活，获得纤维素酶酶活提高的重组菌株；

(6)确定纤维素酶酶活提高的重组菌株中所表达的外源目的基因，或被干扰的内源基因，从而获得与提高纤维素酶酶活相关的蛋白分泌途径相关基因。

10.根据权利要求9所述的快速筛选高与提高纤维素酶酶活相关的蛋白分泌途径相关基因的方法，其特征在于，所述重组菌株为里氏木霉，优选，与蛋白分泌途径相关的基因包括为bip1基因、hac1基因。