[发明专利]一种人GNAQ基因突变检测试剂盒以及ddPCR检测方法

说明书

本发明公开了一种人GNAQ基因突变检测试剂盒以及ddPCR检测方法，包括DNA提取试剂盒、特异性引物、荧光检测探针和数字PCR仪器。所述特异性引物包括上游引物和下游引物，其中上游引物长度为20bp，下游引物长度为23bp；所述荧光探针包括野生型荧光检测探针和突变型荧光检测探针。本发明设计合理，结构简单，可以直接获取组织中该位点的突变频率。检测探针的3’端均有MGB‑NFQ修饰，野生型检测探针5’端具有FAM荧光基团修饰，突变型检测探针5’端具有HEX荧光基团修饰。

技术领域

本发明涉及分子生物学和医学领域，具体是一种人GNAQ基因突变检测试剂盒以及ddPCR检测方法。

背景技术

葡萄酒色斑(Port-wine stains，PWS)为最常见的毛细血管畸形(Capillarymalformation)，又称鲜红斑痣，系先天性皮肤毛细血管扩张畸形，发病率为0.3％～0.5％，常在出生时出现，好发于头、面、颈部，也可累及四肢和躯干。表现为边缘清楚而不规则的红斑，压之褪色或不完全褪色。红斑颜色常随气温、情绪等因素而变化。随着年龄的增长，病灶颜色逐渐加深、增厚，并出现结节样增生。部分严重的病变可伴有软组织，甚至骨组织的增生，导致患部增大变形等。65％的患者的病灶将逐渐扩张，在40岁前可增厚，出现结节，于创伤后易于出血。组织病理学研究表明鲜红斑痣是由位于真皮上层异常扩张的血管丛组成，深度约为100-1000μm，直径10-300μm，而表皮层未见异常。

在临床实践中发现，近些年来，脉冲染料激光与光子治疗技术在鲜红斑痣治疗领域取得了长足的进步，但临床疗效仍不尽人意，只有约10％的患者可获得完全清除。长时间停止治疗后，部分皮损的颜色会加深。Huikeshoven等采用颜色测量的方法对51例接受脉冲染料激光治疗的患者进行随访，治疗前、5次治疗后、最后一次随访时分别进行颜色测量，研究结果表明5次治疗后的效果并非持久不变，随着时间延长，皮损的颜色会逐步加深。

经过临床研究发现，通过施加药物进行干预(脉冲染料激光/雷帕霉素等)，而不同患者对于药物的敏感性存在较大的差异。且如何在PWS(Port-Wine Stain，葡萄酒色斑) 中分辨其中的SWS(Sturge-Weber syndrome,Sturge-Weber综合症)颅面部血管瘤存在很大的困难。

根据血管瘤和脉管畸形诊断和治疗指南(2016版)，目前单纯葡萄酒色斑根据病史、临床表现即可诊断。其组织病理学改变为真皮浅层毛细血管网扩张畸形，管壁仍为单层内皮细胞构成，表皮层及其周围组织正常。囿于各医院诊疗条件等主客观因素，本疾病存在着漏诊、误诊的可能。根据本指南并通过对大量临床样本的临床研究发现，在鲜红斑痣患者组织中GNAQ基因的pos.80412493存在错义突变，突变频率约为5％左右，突变型(即阳性)与野生型(即阴性)结果提示后续治疗应采用不同方案，可以避免疾病进展为恶性且将治疗副作用减少到最低。目前采用的组织学或其他技术手段尚未由足够的敏感性和特异性分辨此类型的突变，而数字液滴PCR(ddPCR)检测灵敏度高、操作简便适合此类型疾病的诊断。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人GNAQ基因突变检测试剂盒以及ddPCR检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种人GNAQ基因突变检测试剂盒，包括DNA提取试剂盒、特异性引物、荧光检测探针和数字PCR仪器，所述特异性引物包括上游引物和下游引物，其中上游引物长度为20bp，下游引物长度为23bp；所述荧光探针包括野生型荧光检测探针和突变型荧光检测探针。

作为本发明进一步的方案：所述DNA提取试剂盒为QIAamp DNAMini。

作为本发明进一步的方案：所述荧光检测探针和特异性引物对如下：

上游引物：5'-CTTAATGACTTGGACCGCGT-3'