[发明专利]一种小型化的多角度三维超分辨光片荧光显微镜

说明书

本发明公开了一种小型化的多角度三维超分辨光片荧光显微镜，包括：光源模块、光片生成模块、样品控制模块和图像采集模块；光源模块用于形成一束准直的椭圆光；光片生成模块用于根据所述准直的椭圆光生产光片；样品控制模块用于当所述光片照射在样品上时控制样品移动以被光片扫描；图像采集模块用于将激发样品的荧光同步采集后形成图像序列。本发明具有较高的性价比，采用了较少的元件，其硬件装置相比大型的贝塞尔光片，商业化的光片显微镜等要精简小巧，操作简单，具有很大的实用价值。

技术领域

本发明属于显微成像领域，更具体地，涉及一种小型化的多角度三维超分辨光片荧光显微镜。

背景技术

光片荧光显微镜是本世纪兴起的一种新型显微成像技术。与传统的落射荧光显微镜不同，光片荧光显微镜的照明和采集是相互独立的，即照明光源和探测采集相互垂直。利用一种片状的光源从侧面去激发样品的荧光，利用宽场采集照明层的激发的荧光图像，通过扫描获取二维图像序列来重构三维。相比普通的宽场荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜，光片显微镜具有较低的光毒性和光漂白性，较高的轴向分辨率，较快的成像速度。光片荧光显微镜的这些特点使得对生物组织/生物体的三维、动态观察成为可能，已在生物医学成像领域得到广泛的关注。

随着光片技术的研究，多种光片技术不断被开发出来，如平面选择照明光片(selective plane illumination microscopy，SPIM)，数字扫描光片(digital scanninglight-sheet microscopy，DSLM)，贝塞尔光片(Bessel light-sheet microscopy)等不同类型的光片技术。后两种技术由于涉及到光束的扫描及与相机快门的同步，在系统实施上稍微复杂一些。由于SPIM是基于高斯光束，会涉及到高斯光束束腰与瑞丽距离的矛盾，即轴向分辨率与成像视场(field of view，FOV)的矛盾。光片越薄，轴向分辨率越高，但可用的视野(瑞利范围)就越小，难以观测较大的生物样品。并且，即使在瑞丽范围内，其轴向分辨通常亦不如横向分辨率。Mspim(多视角光片荧光显微镜)通过将多个视角拍摄的光片三维图像融合，可获得与横向相当的轴向分辨率。但即便如此，横向(轴向)分辨率与视野的矛盾依然存在。对于发育生物学，神经生物学，病理学等领域里需要频繁观测的胚胎、组织、器官等数毫米介关尺度的大样本，其空间分辨率仍然难以满足要求。

同时，现有的商业化光片荧光显微镜，价格昂贵，动辄数百万元，而且操作繁琐，体积庞大。

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种小型化的多角度三维超分辨光片荧光显微镜，旨在解决现有技术中大视野和高分辨的矛盾，横向分辨率和轴向分辨率的矛盾，本发明能进一步提高分辨率且小巧，易于组装，成本低。

本发明提供了一种小型化的多角度三维超分辨光片荧光显微镜，包括：光源模块、光片生成模块、样品控制模块和图像采集模块；光源模块用于形成一束准直的椭圆光；光片生成模块用于根据所述准直的椭圆光产生两束光片并对两束对射光片进行调整使其在三维空间对齐；；样品控制模块用于当所述光片照射在样品上时控制样品移动以被光片扫描；图像采集模块用于将激发样品的荧光同步采集后形成图像序列。

光片生成模块可以省去光学接力透镜组，使用少量光学元件和短光程即实现第一、第二光片的精确对齐。

其中，光源模块包括：激光器、光纤准直器，扩束整形模块和可调狭缝；光纤准直器、可调狭缝和扩束整形模块依次设置在激光器的出射光的光轴上，激光器的出射光经光纤准直器准直后再经可调狭缝调整，扩束整形模块对经可调狭缝调整后椭圆光束的短轴高度进行调节，以实现光片厚度的动态调整。

其中，扩束整形模块包括：依次设置在光轴上的两枚柱面镜，两枚柱面镜呈平行放置，以实现对光束进行某一个维度的整形成椭圆光束。