[发明专利]一种条件性细胞永生化慢病毒载体及其构建方法和在猪卵巢颗粒细胞建系中的应用

说明书

本发明公开了一种条件性细胞永生化慢病毒载体的构建方法，本发明还公开了用该种慢病毒载体包装所获得的pLVX‑Tet3G‑Large T‑T2A‑mCherry‑Puro^r慢病毒及其在猪卵巢颗粒细胞建系中的应用。本发明首次通过Tet‑on‑3G系统建立可逆型和可诱导的猪卵巢颗粒细胞系，该细胞系具有可诱导和反转的特征。当添加Dox时，可以在体外稳定维持细胞增殖；当去除Dox时，卵巢颗粒细胞可以分化成功能的终末细胞，分泌更多雌激素和孕激素，但这时丧失了增殖能力；当再次添加Dox时，细胞仍会重新回归到增殖状态。该可逆型细胞系对于研究细胞增殖，分化和去分化具有重要的意义，同时根据卵巢颗粒细胞生物学性质，本发明的细胞系在对于研究卵巢颗粒细胞激素分泌和卵母细胞发育调控具有重要应用价值。

技术领域

本发明涉及基因生物工程领域，特别涉及一种慢病毒载体及其构建方法和在猪卵巢颗粒细胞系中的应用

背景技术

卵巢颗粒细胞(Granulosa cells，GCs)是处于卵泡中的一类重要细胞，分泌雌激素和孕酮，对卵母细胞的发育、排卵和妊娠的维持有重要的调节作用。体外培养的新分离的GCs 在研究雌性动物激素合成和卵母细胞发育的应用中是重要价值，同时也为获取诊断和治疗雌性生殖疾病建立方法鉴定基础，实施减少家畜的生殖损失等方面提供技术支持。然而，体外培养的GCs细胞易于分化，有限的增殖潜力，限制了它的应用和研究。

很多研究结果显示一般通过转入外源Large T或端粒酶逆转录酶(Tert)去建立原代细胞长期培养，Large T通过抑制细胞周期抑制因子P53和pRb，以促进细胞的增殖和抗衰老，使细胞获得永生。建立永生的GCs系，虽保留主要GCs基因表达模式和部分功能特征，却失去分化功能和很多原代细胞的特征。

以往研究显示已经建立了很多猪的颗粒细胞，已有6株颗粒细胞系(名为MDG2.1，PGC-2，jc–410，CG-9，PGV3，AVG-16)文章报道，但目前市场上仍缺乏可用的颗粒细胞系，这些报道的颗粒细胞系并不是理想细胞模型去研究猪GCs功能，因为这些细胞系失去应对促卵泡激素(FSH)、促黄体激素(LH)刺激而促进类固醇激素，如雌二醇(E2)和孕酮(P4)的分泌，也不能产生抑制素和体外分化，和原代细胞相比存在很大差异。实际上大部分细胞系由于将Large T或Tert整合到基因组中而失去生理功能，和原代细胞生理功能相差很远。

近年来，条件性基因表达研究受到了极大的关注。一些研究试图通过“Cre/loxps”的方法移除Large T或Tert基因，以获得具有分化功能细胞，取得了成功。本发明成功应用Tet-on-3G方法建立可逆型和可诱导的猪卵巢颗粒细胞系。

发明内容

本发明的目的在于针对上述现有技术的不足，利用慢病毒转基因的方法，通过Tet-on-3G 系统建立可逆型和可诱导的猪卵巢颗粒细胞系，其兼具可诱导细胞体外增殖和可恢复细胞体外分化的特征。

本发明所采取的一个技术方案是：提供一种条件性细胞永生化慢病毒载体的构建方法，其包括步骤：

1)根据分子克隆技术，通过Nhe1和Bamh1双酶切Tet-on-3G慢病毒载体，回收7595bp 载体片段；

2)利用引物1和引物2，以pLVX-Large T-EF1-EGFP为模板扩增获得Large T-T2A片段，所述引物1和引物2的序列如SEQ ID NO1和2所示；利用引物3和引物4，以 pLVX-sgRNA-mCherry为模板扩增获得T2A-mCherry片段，所述引物3和引物4的序列如 SEQ ID NO3和4所示；

3)以步骤2)所得Large T-T2A片段和T2A-mCherry片段为模板，添加引物1和引物4，进行重叠PCR扩增，获得LargeT-T2A-mCHRRY的DNA片段，通过Nhe1和Bamh1进行双酶切，回收；