[发明专利]柑橘显性功能突变体的制备方法

说明书

本发明公开了一种柑橘显性功能突变体的制备方法，包括：步骤一、利用第一对引物对，以pCAMBIA1300载体为模板，扩增得到含有转移DNA结构域的载体骨架，之后将第一强启动子基因、报告基因和第二强启动子基因连接入该载体骨架转移DNA结构域的左右两边界之间，构建获得转移DNA结构域含有目标序列的目的载体；步骤二、通过农杆菌介导的转化法将目标序列整合到柑橘幼苗基因组上，筛选得到阳性转化子；步骤三、将阳性转化子培养成植株之后定植在土壤中或嫁接到砧木上保存，得到柑橘显性功能突变体。本发明创制出当代即可利用的柑橘遗传材料，解决了当前无法利用T‑DNA插入方法快速创制出直接可以利用的柑橘突变体的问题。

技术领域

本发明属于生物技术研发技术领域，涉及一种柑橘显性功能突变体的制备方法。

背景技术

T-DNA序列插入植物基因组后，能破坏插入位点基因的转录。将有T-DNA序列插入的植株通过自交回交等方法能在其子代中获得该基因T-DNA插入纯合的株系，即能获得到该基因功能缺失的突变体。利用获得的T-DNA插入纯合突变体与野生型等植物材料在不同生长条件下进行表型检测，已成为发掘鉴定拟南芥、水稻等植物功能基因的重要手段。但，柑橘的童期长，从种子生长成实生植株结出果实一般需要至少5年以上，因此柑橘不容易通过自交回交等方法快速获得相关基因插入纯合的植物材料，这也是至今无法利用大规模构建柑橘T-DNA插入突变群体的方法来发掘鉴定柑橘农艺性状功能基因的重要原因。

在T-DNA内的边界处安装组成型强启动子能对插入位点附近基因的表达产生影响。当边界处含强启动子的T-DNA插入植物基因组中时，既可能干扰插入位点处基因的正常表达(RNAi)，产生该基因沉默的功能缺失性突变体，也可能导致插入位点附近处基因过量表达，产生基因过量表达的功能获得性突变体。这些显性的功能突变体无需进行自交杂交等纯化过程，当代的株系即可与其他植物材料进行表型比较来发掘鉴定植物性状功能基因，这比利用纯合T-DNA插入基因敲除突变体来鉴定基因功能的方法至少可节约繁育该植物1代的时间。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种柑橘显性功能突变体的制备方法。

为此，本发明提供的技术方案为：

一种柑橘显性功能突变体的制备方法，包括如下步骤：

步骤一、利用如SEQ ID NO：1和2所示的第一对引物对，以pCAMBIA1300载体为为模板，扩增得到含有转移DNA结构域的载体骨架(pCAMBIA1300质粒来自于湖南省园艺研究所实验室；PCR的反应体系(30μL)：10×PCR缓冲液3μL，dNTPs(each 2.5mmol/L)1μL，正向引物(10μmol/L)0.5μL，反向引物(10μmol/L)0.5μL，Pyrobest DNA聚合酶(5U/μL)1μL，模板(0.2μg/L)1μL，无菌去离子水23μL；扩增条件：95℃5min；95℃20s，55℃20s，72℃6min，25个循环；72℃10min)，之后将第一强启动子基因、报告基因和第二强启动子基因均连接入该载体骨架的转移DNA结构域的左右两边界之间，构建获得转移DNA结构域含有目标序列的目的载体，其中，第一强启动子位于报告基因的上游，第二强启动子位于报告基因的下游；

步骤二、通过农杆菌介导的转化法将目标序列整合到柑橘幼苗基因组上，筛选以得到含有报告基因的阳性转化子；

步骤三、将所述阳性转化子培养形成完整植株，之后定植在土壤中或嫁接到砧木上保存，得到柑橘显性功能突变体。

优选的是，所述的柑橘显性功能突变体的制备方法中，所述步骤一中，所述报告基因采用GUS基因；

利用如SEQ ID NO：3和4所示的第二对引物对，以pBI121载体为模板，扩增得到含有所述GUS基因的产物。