[发明专利]一种用LMH细胞系生产禽腺病毒4型疫苗的方法及疫苗

权利要求书

1.用LMH细胞系生产禽腺病毒4型疫苗的方法，包括LMH细胞系制备，病毒接种繁殖，病毒收集、浓缩、纯化和疫苗成品配制步骤，其特征在于，所述LMH细胞系制备包括以下步骤：

S1、使用含有0.8％(v/v)新生牛血清、100IU/ml青霉素以及0.25％(v/v)N-乙酰-D-氨基葡萄糖的细胞培养液对LMH细胞进行培养，至细胞生长至30～55％密度，使用胰酶-EDTA对细胞进行消化和分散；

S2、使用含有0.8％(v/v)新生牛血清、100IU/ml青霉素以及1.25％(v/v)N-乙酰-D-氨基葡萄糖的细胞培养液对步骤S1得到的LMH细胞进行培养，至细胞生长至60～75％密度，使用胰酶-EDTA对细胞进行消化和分散；

S3、使用含有0.8％(v/v)新生牛血清、100IU/ml青霉素以及2.5％(v/v)N-乙酰-D-氨基葡萄糖的细胞培养液对步骤S2得到的LMH细胞进行培养，直至形成生长良好的细胞单层；

S4、将禽腺病毒4型接种到制备得到的LMH细胞单层中并进行病毒吸附，使用含有0.1～1.0％(v/v)新生牛血清和100IU/ml青霉素的细胞维持液于37℃、5％CO₂培养60h，直至细胞病变CPE达到80％以上，收获细胞毒液；

S5、将收获的细胞毒液于-20℃反复冻融2～3次，离心，超滤浓缩，即得制苗病毒液；

S6、往制苗毒液中加入灭活剂进行灭活，得疫苗抗原，往疫苗抗原中加入常规乳化剂乳化制得灭活疫苗。

2.一种制备鸡传染性法氏囊和禽腺病毒4型二联灭活疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：

A)禽腺病毒4型病毒液制备：

S1、使用含有0.8％(v/v)新生牛血清、100IU/ml青霉素以及0.25％(v/v)N-乙酰-D-氨基葡萄糖的细胞培养液对LMH细胞进行培养，至细胞生长至30～55％密度，使用胰酶-EDTA对细胞进行消化和分散；

S2、使用含有0.8％(v/v)新生牛血清、100IU/ml青霉素以及1.25％(v/v)N-乙酰-D-氨基葡萄糖的细胞培养液对步骤S1得到的LMH细胞进行培养，至细胞生长至60～75％密度，使用胰酶-EDTA对细胞进行消化和分散；

S3、使用含有0.8％(v/v)新生牛血清、100IU/ml青霉素以及2.5％(v/v)N-乙酰-D-氨基葡萄糖的细胞培养液对步骤S2得到的LMH细胞进行培养，直至形成生长良好的细胞单层；

S4、将禽腺病毒4型接种到制备得到的LMH细胞单层中并进行病毒吸附，使用含有0.1～1.0％(v/v)新生牛血清和100IU/ml青霉素的细胞维持液于37℃、5％CO₂培养60h，直至细胞病变CPE达到80％以上，收获细胞毒液；

S5、将收获的细胞毒液于-20℃反复冻融2～3次，离心，超滤浓缩，即得制苗病毒液；

B)将制备得到的禽腺病毒4型病毒液和鸡传染性法氏囊病毒液等体积混合，使得每0.1ml水相中禽腺病毒4型病毒含量≥10^8.5TCID₅₀，鸡传染性法氏囊病毒含量≥10^8.0TCID₅₀，灭活，浓缩，加入常规的疫苗抗原乳化剂。

3.一种制备鸡新城疫、禽流感H9亚型病毒和禽腺病毒4型三联灭活疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：

A)禽腺病毒4型病毒液制备：

S1、使用含有0.8％(v/v)新生牛血清、100IU/ml青霉素以及0.25％(v/v)N-乙酰-D-氨基葡萄糖的细胞培养液对LMH细胞进行培养，至细胞生长至30～55％密度，使用胰酶-EDTA对细胞进行消化和分散；

S2、使用含有0.8％(v/v)新生牛血清、100IU/ml青霉素以及1.25％(v/v)N-乙酰-D-氨基葡萄糖的细胞培养液对步骤S1得到的LMH细胞进行培养，至细胞生长至60～75％密度，使用胰酶-EDTA对细胞进行消化和分散；

S3、使用含有0.8％(v/v)新生牛血清、100IU/ml青霉素以及2.5％(v/v)N-乙酰-D-氨基葡萄糖的细胞培养液对步骤S2得到的LMH细胞进行培养，直至形成生长良好的细胞单层；

S4、将禽腺病毒4型接种到制备得到的LMH细胞单层中并进行病毒吸附，使用含有0.1～1.0％(v/v)新生牛血清和100IU/ml青霉素的细胞维持液于37℃、5％CO₂培养60h，直至细胞病变CPE达到80％以上，收获细胞毒液；

S5、将收获的细胞毒液于-20℃反复冻融2～3次，离心，超滤浓缩，即得制苗病毒液；

B)将制备得到的禽腺病毒4型病毒液与鸡新城疫病毒液和禽流感病毒液等体积混合，使得每0.1ml水相中禽腺病毒4型病毒含量≥10^8.5TCID₅₀，鸡新城疫病毒含量＞10^8.3TCID₅₀，禽流感H9亚型病毒≥10^7.5TCID₅₀，灭活，浓缩，加入常规的疫苗抗原乳化剂。