[发明专利]一种EGFR/ALK/ROS1基因突变联合检测方法及检测试剂盒

说明书

本发明公开了一种EGFR/ALK/ROS1基因突变联合检测方法，包括以下步骤：提取样本DNA；设计用于扩增EGFR/ALK/ROS1基因片段的特异性引物；利用单管多重PCR扩增反应得到目标片段；设计用于EGFR/ALK/ROS1基因片段的单碱基延伸引物；EGFR/ALK/ROS1基因片段单碱基延伸；核酸质谱分析测量目标DNA序列，能够有效地对非小细胞肺癌患者展开EGFR/ALK/ROS1基因突变联合检测，为此类患者开展个性化精准诊治奠定临床及科研基础。本发明还涉及一种EGFR/ALK/ROS1基因突变联合检测试剂盒。

技术领域

本发明涉及生物医学领域，尤其是涉及一种EGFR/ALK/ROS1基因突变联合检测方法及检测试剂盒。

背景技术

在肺癌分子靶向治疗领域，研究热点主要集中在EGFR、ALK和ROS1靶点上。在NSCLC患者中，东亚人群EGFR基因突变比例约为35-40％，约90％突变为外显子19缺失和L858R突变；ALK基因融合比例约为3～11％；ROS1基因融合比例约为2-4％。

EGFR基因是NSCLC患者接受酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine Kinase Inhibitors,TKIs)如易瑞沙、特罗凯、凯美纳等靶向药物治疗的重要生物标记物，ALK基因融合和ROS1基因融合的NSCLC患者可从靶向药物赛可瑞治疗中获益。

美国国立综合癌症网络(NCCN)临床实践指南、欧洲肿瘤内科学会(ESMO)肺癌共识以及中国晚期非小细胞肺癌分子靶向治疗专家共识均明确建议：NSCLC患者在接受治疗之前应先检测EGFR、ALK和ROS1基因，根据基因状态决定相应的治疗策略，并建议有条件的单位同时进行三个基因的检测。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种EGFR/ALK/ROS1基因突变联合的检测方法和检测试剂盒。

一种EGFR/ALK/ROS1基因突变联合检测方法，包括以下步骤：提取样本DNA；设计用于扩增EGFR/ALK/ROS1基因片段的特异性引物；利用单管多重PCR扩增反应得到目标片段；设计用于EGFR/ALK/ROS1基因片段的单碱基延伸引物；EGFR/ALK/ROS1基因片段单碱基延伸；核酸质谱分析测量目标DNA序列。

进一步地，所述EGFR/ALK/ROS1基因突变联合片段包括EGFR-1片段、ALK-2片段及ROS1-3片段。

进一步地，所述用于扩增EGFR/ALK/ROS1基因片段的特异性引物包括：用于扩增所述EGFR-1片段的特异性引物，正向引物为：SEQID Nos：1或2，反向引物为SEQ ID Nos：3或4；用于扩增所述ALK-2片段的特异性引物，正向引物为：SEQ ID Nos：5或6，反向引物为SEQ IDNos：7或8；用于扩增所述ROS1-3片段的特异性引物，正向引物为：SEQ ID Nos：9或10，反向引物为SEQ ID Nos：11或12。

进一步地，所述用于EGFR/ALK/ROS1基因片段的单碱基延伸引物包括：用于EGFR-1片段的单碱基延伸引物，序列为SEQ ID Nos：61；用于ALK-2片段的单碱基延伸引物，序列为SEQ ID Nos：62；用于ROS1-3片段的单碱基延伸引物，序列为SEQ ID Nos：63。

进一步地，所述利用单管多重PCR扩增反应包括以下步骤：Taq酶激活，DNA变性。

进一步地，Taq酶激活时温度为95℃。

进一步地，Taq酶激活时间为15分钟。

进一步地，DNA变性时温度为95℃。

进一步地，DNA变性时间为15秒。