[发明专利]一种含羟基的神经类固醇的检测分析方法

说明书

本发明涉及分析化学领域，具体涉及一种含羟基的神经类固醇的检测分析方法，该方法以d₀/d₃‑3‑N‑甲基‑2‑羧基罗丹明6G作为同位素标记衍生试剂，用d₀/d₃‑MCR6G标记衍生实际样品和标准品，以d₃‑MCR6G标记的标准品作为内标，得到的轻/重标记衍生化产物混合，纯化和富集，经滤膜过滤后利用超高效液相色谱三重四极杆串联质谱系统进行分析检测。本发明设计合成的自身带有一分子正电荷的d₀/d₃‑3‑N‑甲基‑2‑羧基罗丹明6G（d₀/d₃‑MCR6G）做衍生试剂，可在液质联用多反应检测模式中提高色谱的分离能力和质谱的离子化效率，进而提高检测的灵敏度，而且衍生反应快速、产物稳定。

技术领域

本发明涉及分析化学领域，具体涉及一种含羟基的神经类固醇的检测分析方法，尤其是涉及一种首次合成并使用的d₀/d₃-3-N-甲基-2-羧基罗丹明6G（d₀/d₃-MCR6G）作为稳定同位素标记衍生试剂，衍生产物经磁分散固相萃取纯化和富集后，采用超高效液相色谱三重四极杆质谱检测的分析方法。

背景技术

帕金森病（PD）是一种多发于中老年人的神经退行性疾病，随社会老龄化的加重，引起人们的广泛关注。有报道证明神经类固醇含量的变化与PD紧密相关并具有重要的研究意义，了解神经类固醇与PD之间的关系不仅有助于人们获得更高的生活质量，而且还有助于评估其神经保护作用以开发新的治疗方法。然而由于其含量低及生物样品中复杂的基质效应，以及神经类固醇在质谱负离子模式下有较弱的离子化效率，使其定量检测面临巨大的挑战。

现有技术中，采用多种不同的分析方法实现对神经类固醇的定量检测，如生物传感法、电化学检测法、液相色谱紫外检测法以及质谱检测等方法。文献《Magnetic sensingfilm based on Fe3O4@Au-GSH molecularly imprinted polymers for theelectrochemical detection of estradiol》（Biosensors and Bioelectronics 79(2016) 180–186）采用电化学检测的方法实现对奶粉中雌二醇的定量检测。文献《A newone-step antigen heterologous homogeneous fluorescence immunoassay forprogesterone detection in serum》（Talanta 134 (2015) 508–513）采用均相免疫分析方法实现对人血清中孕酮的含量测定。然而以上两种方法在应用到实际生物样品中时，由于神经类固醇在生物样品中浓度低，且存在内源性干扰等，方法的灵敏度和准确度不足。文献《LC–MS/MS simultaneous analysis of allopregnanolone, epiallopregnanolone,pregnanolone, dehydroepiandrosterone and dehydroepiandrosterone 3-sulfate inhuman plasma》（Bioanalysis (2017) 9(6), 527–539）采用2-肼基吡啶作为衍生试剂对人体血浆中的神经类固醇定量检测，相比而言使用该方法对多种神经类固醇的检测，在色谱分离度和质谱选择性、灵敏度方面有所提高，但该方法直接检测存在潜在的色谱分离干扰、质谱检测离子化效率较低的缺点。专利（CN 104807921 A）先利用高效液相色谱将人血清中的 10 种类固醇激素分离，再利用质谱同位素内标的方法定量检测，该方法一定程度上提高了检测的灵敏度、准确度。但是并非所有的生物代谢物均可找到商品化的同位素标准品，且该类标准品价格较为昂贵。因此，设计合成合适的同位素标记衍生试剂，开发一种对实现多种神经类固醇同时高灵敏、高准确性的检测具有重要意义。

发明内容