[发明专利]一种绵羊羔羊瘤胃上皮细胞培养方法

说明书

本发明公开一种绵羊羔羊瘤胃上皮细胞培养方法，包括如下步骤：获取羔羊瘤胃组织；钝性分离黏附的浆膜层和肌肉层；将瘤胃组织裁剪，用胰蛋白酶溶液消化，直至瘤胃上皮组织呈现粘性且乳头发白；用胰蛋白酶继续消化，收集细胞；把收集到的细胞沉淀清洗，用完全培养基重悬细胞后，接种于培养瓶中培养；换瓶培养，定期更换培养基，完成铺层，即培养所得的细胞为瘤胃上皮细胞。本发明对瘤胃上皮细胞分离培养进行改进，通过此法能有效获得活力高，贴壁早，生长快的瘤胃上皮细胞。普通消化分离方法所得的细胞接种后3～6d开始贴壁，8～10d完成铺层，而本发明的消化分离方法所得的细胞在2～3d开始贴壁，5～6d完成铺层。

技术领域

本发明涉及细胞分离培养领域，尤其是一种绵羊羔羊的瘤胃上皮细胞的分离培养方法。

背景技术

现在细胞体外培养技术已成为现代生物学研究领域中应用最广泛的技术。细胞体外培养具有实时监控(监测时可定量评估细胞形态、结构和生命活动等)、研究条件可控性强(便于各种物理、化学、生物等外界因素对细胞生长、发育及凋亡等影响的研究)、样本均一性高(便于单因子和多因子分析)、应用范围广泛及费用相对低等优点。

瘤胃是反刍动物对饲料营养物质消化、吸收及能量代谢的重要场所。瘤胃上皮系统作为发挥瘤胃功能的主要部位之一，可对挥发性脂肪酸以及Ca²⁺的吸收产生影响，并对瘤胃的酸化起到预防作用，且对母畜的分娩期、泌乳早期健康、泌乳性能及产后恢复有直接影响。瘤胃上皮细胞在一定条件应用于体外分离和培养。王远孝等对离体瘤胃上皮细胞在瘤胃代谢的研究进行综述，得出离体瘤胃上皮细胞培养技术可以应用于研究瘤胃上皮组织形态和代谢过程。目前，在上皮细胞培养中普遍使用胰蛋白酶和胶原酶，Baldwin等应用系列胰酶消化方法，虽然成功分离出足够数量的活细胞但只能进行短期培养，在测定2h培养期内BHBA生成时，发现培养的也主要是角质层始点细胞。Galfi等采用相同的方法，成功地分离培养出了绵羊瘤胃上皮细胞，但是该法需约8h从基底层和棘层中分离出细胞，限制了上皮细胞代谢研究中的应用。此外，余燕等尝试采用0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA对成年牛瘤胃上皮组织进行冷消化18h，虽然获得大量细胞但细胞活性较差，培养时发现细胞大多很快死亡，其可能原因在于低温下细胞代谢较弱，能较好地保持细胞内营养。

目前在许多瘤胃上皮细胞的体外培养试验中发现瘤胃上皮细胞贴壁时间长，增殖缓慢，容易污染且不能传代等诸多问题。说明这些瘤胃上皮细胞的分离培养方法效果不佳，因此改进和优化瘤胃上皮细胞的体外分离和培养技术有助于深入了解瘤胃上皮代谢及功能方面的作用。

发明目的

发明内容：针对现有瘤胃上皮细胞分离培养存在的问题，本发明提供一种新型羔羊瘤胃上皮细胞培养方法，该培养方法目的在于改进和优化瘤胃上皮细胞的分离培养技术，以期获得活力高，贴壁早，形态好，生长快的瘤胃上皮细胞。

技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述的一种绵羊羔羊瘤胃上皮细胞的分离培养方法，包括如下步骤：

(1)获取羔羊瘤胃后腹盲囊靠近后沟处组织，将瘤胃内容物冲洗干净；

(2)用分离工具钝性分离黏附的浆膜层和肌肉层并清洗瘤胃组织；

(3)将瘤胃组织裁剪，用胰蛋白酶溶液消化，直至瘤胃上皮组织呈现粘性且乳头发白，进行清洗；

(4)清洗后用胰蛋白酶继续消化，每隔一段时间收集一次细胞悬液，将细胞悬液过滤后混合，离心收集细胞；

(5)收集到的细胞沉淀用D-Hanks清洗，用完全培养基重悬细胞后，接种于含有完全培养基的培养瓶中培养；

(6)换瓶培养以去除成纤维细胞；定期更换培养基，完成铺层，即培养所得的细胞为瘤胃上皮细胞。

其中，步骤(1)所述瘤胃内容物先用灭菌的D-Hanks溶液冲洗干净，然后用含6倍青链霉素的D-Hanks溶液各方向刷洗多次，直至溶液出现澄清为止。