[发明专利]基于CRISPR-Cas9的基因组无痕编辑的载体与应用

权利要求书

1.一种基于CRISPR-Cas9的热带假丝酵母基因组无痕编辑的载体，结构为同源臂、sgRNA基因、启动子pGAL、Cas9、正向筛选标记、原核生物的复制起始位点六个组件顺次连接组成环形载体；

所述基于CRISPR-Cas9的热带假丝酵母基因组无痕编辑的载体的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

2.如权利要求1所述的载体，其特征在于，所述Cas9基因启动子为受半乳糖诱导的启动子pGAL，启动子pGAL的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.如权利要求1所述的载体，其特征在于，所述正向筛选标记选自G418基因。

4.权利要求1所述基于CRISPR-Cas9的热带假丝酵母基因组无痕编辑的载体在无痕编辑中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤如下：

(1)制备热带假丝酵母的感受态细胞；

(2)将上述基于CRISPR-Cas9的热带假丝酵母基因组无痕编辑的载体与步骤(1)制得的感受态细胞混合均匀后，进行电转化，制得转化细胞；

(3)将转化细胞复苏培养后，在含G418浓度800～1000μg/mL的固体YPD培养基上进行筛选培养，筛选抗G418的菌株；

(4)将步骤(3)制得的抗G418的菌株在含有5～15g/L半乳糖的筛选培养基筛选培养，制得编辑后的细胞。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)中的热带假丝酵母为热带假丝酵母(Candida tropicalis)CICC1798。

7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)中，制备热带假丝酵母的感受态细胞的具体步骤如下：

取热带假丝酵母单菌落，培养至菌体浓度OD₆₀₀为1.0～1.8，置于冰上冷却，离心，用预冷的电转缓冲液洗涤菌体3～5次，电转缓冲液重悬菌体，制得热带假丝酵母感受态细胞。

8.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤(2)中，电转化条件为：1300～1800V、5～10ms连续电击2～3次。

9.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤(3)中，复苏培养条件为：28～32℃、150～200r/min摇床复苏培养40～80min。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述复苏培养的复苏培养基组份为浓度1mol/L的山梨醇溶液。

11.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤(3)中，筛选培养条件为：28～32℃培养1～2天；

固体YPD培养基组分如下：葡萄糖2g/L、蛋白胨2g/L、酵母浸粉1g/L，琼脂2g/L。

12.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤(4)中，筛选培养条件为：28～32℃、培养24～72h；

筛选培养基组分如下：蛋白胨2g/L、酵母浸粉1g/L。