[发明专利]一种神经红突变体蛋白及其制备方法

说明书

本发明属于生物技术领域，公开了一种神经红突变体蛋白及其制备方法。本发明所述神经红突变体蛋白是基于基因工程和蛋白质工程技术，在人神经红蛋白15位引入半胱氨酸(Cys15)，获得神经红突变体蛋白A15C Ngb，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所述神经红突变体蛋白A15C Ngb的pH稳定性、化学变性稳定性和热稳定性均比WT Ngb有显著提高，可以广泛用于研究人神经红蛋白的结构与功能关系，以及其他基于人神经红蛋白的血红素蛋白分子设计。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种神经红突变体蛋白及其制备方法。

背景技术

神经红蛋白(Neuroglobin，Ngb)是2000首次由德国科学家在人和鼠中发现的一种血红素蛋白，主要在脑、视网膜等神经组织中表达.它由一条含151个氨基酸的肽链和血红素b组成,与脊椎动物的血红蛋白和肌红蛋白相比,其氨基酸序列的同源性很低(20％～25％)，通过序列分析，神经红蛋白比肌红蛋白更为古老。Ngb在低铁和高铁状态下都具有六配位结构，并含有一对二硫键和一个单独的120位半胱氨酸(Cys120)。至今已得知的Ngb生理功能有：①氧载体功能，Ngb较高的氧亲和力能可逆的结合氧；②在缺氧、缺血以及氧化损伤情况下，神经红蛋白会大量表达，保护神经元不受损害；③可以保护神经细胞对抗氧化应激；④可以清除神经细胞中的活性氧物种；⑤可以作为O₂传感器，活化其他蛋白，具有调节功能。但是对Ngb的具体生理学功能仍然不确定，因此构建一种稳定性更好的神经红蛋白对于其结构-性质-功能之间的关系的进一步研究具有重要意义。

构建新型稳定的神经红蛋白，一直是一个探索性的路程。定点突变是研究蛋白质结构、性质与功能关系的有力手段，目前神经红蛋白的定点突变工作主要集中在蛋白质分子内二硫键及血红素轴向配体上。《神经红蛋白突变体(F28Y,F106Y)的构建、表达与表征》一文中报道了在28位和106位引入酪氨酸，构建了神经红蛋白F28Y、F106Y的两种突变体，结果发现神经红蛋白F28Y、F106Y两种单突变体的热稳定性比WT Ngb蛋白还低。另有文献报道在44位引入苯丙氨酸构建了神经红蛋白突变体并进行表征，结果其热稳定性和酸稳定性均较WT Ngb稍低。可见目前还没有提高神经红蛋白稳定性的方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术的缺陷提供一种稳定性高的神经红突变体蛋白及其制备方法。

为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

本发明利用在人神经红蛋白15位引入半胱氨酸(Cys15)，与人神经红蛋白分子内120位的半胱氨酸Cys120形成分子内二硫键，获得神经红突变体蛋白A15C Ngb，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了编码所述的神经红突变体蛋白A15C Ngb的DNA分子。

由于密码子的简并性，可以存在很多种能够编码本发明所述的神经红突变体蛋白的核苷酸序列。

本发明还提供了所述神经红突变体蛋白的制备方法，运用定点突变技术，将神经红蛋白15位突变为半胱氨酸，宿主细胞中表达后分离纯化。

作为优选，本发明所述制备方法所述宿主细胞为大肠杆菌表达菌株，包括Rosetta系列和BL21系列菌株。在一个实施方案中，宿主细胞为BL21(DE3)菌株。

作为优选，本发明所述制备方法所述分离方法为超声破碎菌体。在一些实施方案中，所述超声破碎菌体具体为60W超声破碎1h。

作为优选，本发明所述制备方法所述纯化方法为盐析透析后柱层析纯化。

其中，所述盐析优选为依次进行176g/L、195g/L硫酸铵盐析。

进一步作为优选，所述柱层析纯化具体为依次经过DEAE阴离子交换柱、SephadexG-75凝胶柱、MonoQ阳离子交换柱分离。