[发明专利]利用免疫共沉淀从苹果花粉管中获得级联激酶蛋白的方法

说明书

本发明涉及一种利用免疫共沉淀从苹果花粉管中获得级联激酶蛋白的方法。本发明属于分子生物学和基因功能领域，涉及2个在苹果花粉管生长过程中发挥重要调控作用的促分裂原活化蛋白质激酶MdMAPK3和MdMAPKK4基因，MdMAPK3基因含有1110个核苷酸，编码370个氨基酸，属于MAPK家族成员；MdMAPKK4基因含有1068个核苷酸，编码356个氨基酸，属于MAPKK家族成员。本发明公开了在苹果自交不亲和反应中，由花粉管蛋白激酶MdMAPK3筛选上游蛋白激酶MdMAPKK4并验证其互作关系的方法。

技术领域

本发明属于分子生物学和基因工程领域，涉及2个在苹果自交不亲和反应中发挥重要作用的促分裂原活化蛋白质激酶MdMAPK3和MdMAPKK4。具体为一种在苹果花粉管中利用蛋白质免疫共沉淀技术获得级联激酶蛋白的方法。

背景技术

植物的自交不亲和性反应是一种花柱与花粉间的特异性识别反应，以苹果为代表的蔷薇科果树自交不亲和产生的机制是植物识别自我花粉，造成花粉管在花柱中难以生长至胚珠，不能完成双受精作用。目前，对于苹果自交不亲和机理的研究主要集中于花柱特异表达的S-RNase蛋白作为花柱决定因子，授粉后由花柱细胞特异产生，并在ABCF转运蛋白的协助下非特异性进入花粉管内，自我S-RNase作为“细胞毒素”分解花粉管内rRNA，使花粉管停止生长，最终导致花粉管在花柱生长过程中死亡，无法到达子房完成双受精作用；但随着对自交不亲和现象研究的不断深入，相继发现了众多的调控因子可能参与花粉管在花柱中的生长过程，然而目前尚未有蛋白激酶的相关报道。

蛋白质激酶是一类可以使特定的蛋白质侧链中的丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基共价磷酸化的酶，蛋白质磷酸化可以控制酶的活性及其与其他分子的相互作用。促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)在植物的胁迫反应应答方面占有重要地位。真核生物(酵母、动物和植物)中与MAPK级联途径有关的激酶均为丝/苏氨酸磷酸酶，其基本组成为三级激酶模式，即上游的促分裂原活化蛋白质激酶(MAPKKK)通过将促分裂原活化蛋白质激酶(MAPKK)中保守区域中丝/苏氨酸残基磷酸化而激活MAPKKK，再由MAPKK通过磷酸化MAPK第七和第八亚结构域之间的丝/苏氨酸和酪氨酸残基激活MAPK。MAPK既可以作为信号转导的一个环节继续磷酸化下游的成分，又可以进入细胞核激活转录因子进而调节基因表达。目前已有报道表明，拟南芥的AtMPK3和AtMPK4在花粉管生长过程中具有重要作用。迄今为止，尚未有促分裂原活化蛋白质激酶参与苹果自交不亲和反应和参与调控苹果花粉管生长的相关报道。

发明内容

本发明公开了一种苹果花粉管MAPK类蛋白激酶MdMAPK3基因，所述蛋白激酶MdMAPK3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明还公开了蛋白激酶MdMAPK3基因编码的蛋白激酶MdMAPK3，所述蛋白激酶MdMAPK3的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

所述蛋白激酶MdMAPK3的氨基酸序列中含有保守的STKc_TEY结构域，该结构域能被上游MAPKK家族蛋白激酶结合并被磷酸化。

本发明提供了一种苹果花粉管MAPKK类蛋白激酶MdMAPKK4基因，所述蛋白激酶MdMAPKK4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

本发明还公开了蛋白激酶MdMAPKK4基因编码的蛋白激酶MdMAPKK4，所述蛋白激酶MdMAPKK4的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

所述蛋白激酶MdMAPKK4氨基酸序列中含有保守的PKc_MAPKK结构域，该结构域能与上游MAPKKK类蛋白激酶结合并被磷酸化。

本发明提供了一种从苹果花粉管中获得级联蛋白激酶的方法，包括以下步骤：

1)体外模拟自交不亲和反应体系，处理苹果花粉管；