[发明专利]一种外切型硫酸软骨素酶AC及其制备方法与应用

说明书

本发明提供一种外切型ChSase AC，其DNA序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还提供一种外切型ChSase AC融合蛋白，该融合蛋白融合有上述外切型ChSase AC和纯化标签。本发明还提供一种含有上述外切型ChSase AC的重组载体和转化体。本发明提供的外切型ChSase AC的DNA序列对大肠杆菌的偏好性达到90%以上，从而提高了ChSase AC的DNA序列在大肠杆菌中的表达效率，进而直接降低了ChSase AC的生产成本，有利于ChSase AC的推广应用。另外，本发明还提供一种上述外切型ChSase AC的制备方法和应用。上述外切型ChSase AC可以去除类肝素原料中的硫酸软骨素。

技术领域

本发明属于生物制药领域，具体地，涉及一种外切型硫酸软骨素酶AC及其制备方法与应用。

背景技术

硫酸软骨素酶(chondroitinase或chondroitin sulfateyase，简称为“ChSase”)是一类能将硫酸软骨素、软骨素、透明质酸等糖胺聚糖降解为不饱和二糖(ΔDi及寡糖)的裂解酶。根据其作用底物的差异主要分为ChSase ABC、ChSase AC、ChSase B及ChSase C等类型。

虽然ChSase ABC为特异性最为广泛的一类硫酸软骨素裂解酶，理论上可以对各种类型的硫酸软骨进行切割，但是随后的研究发现，ChSase ABC发挥作用的效果与底物种类的复杂程度有密切关系，当底物中硫酸软骨素的种类越多，ChSase ABC表现出的综合活性越低。所以，其它类型的ChSase AC、ChSase B及ChSase C也是人们研究的重点。比如，目前国际上对ChSase AC的关注越来越多，而且研究显示ChSase AC有多种重要用途，在基础研究中它用来构建二糖和寡糖的基因文库；研究糖胺多糖结构和性质；在临床领域，用来治疗一些疾病。另外有两项新增应用非常重要： 1）在酶法生产低分子量硫酸软骨素CS中作为催化剂应用；2）在类肝素酶法精制中的应用。以上所有ChSase AC推广及应用关键在于获得大量、廉价的硫酸软骨素酶。目前ChSase AC获取的途径是通过Arthrobacteraurescens发酵提纯获得，但是存在Arthrobacteraurescens菌生长缓慢、ChSase AC表达水平低以及分离纯化复杂等问题，从而直接增加了硫酸软骨素酶的生产成本，较低的生产能力和过高的价格是制约其功能研究和应用开发的重要因素。

所以，开发ChSase AC的新型高效表达和纯化技术具有极其重要的研究价值，其成功研制对提升我国ChSase AC生物表达的技术水平及拓展其应用领域具有重要的科学意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种外切型ChSase AC及其制备方法与应用，以解决上述问题。

具体地，本发明采取如下技术方案：

一种外切型ChSase AC，它的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明提供一种外切型ChSase AC融合蛋白，它融合有具有外切型ChSase AC和纯化标签，其中，所述外切型ChSase AC的DNA序列如SEQ ID NO.1所示，所述纯化标签为His标签、MBP标签或GST标签。

基于上述，所述外切型ChSase AC融合蛋白的分子量为79～122 kDa。

基于上述，当底物为硫酸软骨素A时，所述外切型ChSase AC融合蛋白的酶活性为80～9500 IU/L发酵液。

本发明还提供一种重组载体，它包括载体和与所述载体连接的上述外切型ChSaseAC融合蛋白，其中，所述载体为PMAL-C2X、pGEX-4T1或pET-15d。