[发明专利]一种基于高通量测序的线粒体全基因组测序方法

权利要求书

1.一种基于高通量测序的线粒体全基因组测序方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)提取全血细胞总基因组DNA；

(2)设计两组引物，其中第一组引物包含61对引物1，61对引物1覆盖线粒体全基因组，且均包含粘性接头，引物序列分别如SEQ ID NO.1～122所示；第二组引物，包含多个正向引物和相同数量的反向引物，任一正向引物可与任一反向引物进行配对，组成引物2；所述正向引物和反向引物均包含与第一组引物的粘性接头配对的粘性接头，用于标记不同样本；第二组引物中的正向引物包括SEQ ID NO.123～126，反向引物包括SEQ ID NO.127～130；

(3)将多个不同来源的全血细胞总基因组DNA，利用交叉混合一步法分别进行PCR扩增，扩增子的长度不大于450bp；

(4)将步骤3获得的所有扩增子混合纯化后使用Illumina Hiseq2500 PE250进行建库及测序；

(5)测序数据进行分析。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3具体为：

在PCR反应中，同时加入引物1和引物2进行PCR扩增；对于每个全血细胞总基因组DNA，采用同一个引物2以及61个引物1进行61次PCR扩增，以获得带有引物2特征的覆盖线粒体全基因组的61个扩增子；对于不用来源的全血细胞总基因组DNA，采用不同的引物2进行特征标记；PCR体系如下：

高保真酶	5μl
10μM上游引物序列(引物1-F)	0.17μl
10μM下游引物序列(引物1-R)	0.17μl
10μM上游引物序列(引物2-F)	0.34μl
10μM上游引物序列(引物2-R)	0.34μl
2O]]>	3μl
待测样本DNA(均稀释至20-40ng/μl)	1μl

PCR反应条件如下：

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)的具体操作步骤如下：根据步骤(3)中，引物2与全血细胞总基因组DNA来源的对应关系，确定IlluminaHiSeq测序结果中每一个片段的来源，未被识别片段丢弃。将同一来源的片段，进行首尾拼接。