[发明专利]一种用于基因检测的血小板核酸文库构建方法和试剂盒

说明书

本发明公开了用于基因检测的血小板核酸文库构建方法和试剂盒。所述核酸捕获探针从5'开始，依次为，5'端生物素修饰、扩增引物序列P1、测序接头序列P5、样本标签序列、单分子标签序列和多聚胸腺嘧啶Oligo(dT)序列。还提供含有该核酸捕获探针的试剂盒，和使用该核酸捕获探针进行血小板核酸文库的构建方法。本发明大幅度降低了血小板的起始量，可从少量全血中分离血小板，直接进行微量扩增和文库构建，适用于液体活检的需求。此外，本发明可将不同受检者的样本混合至同一反应体系中，从而提高检测的通量，具有重要的临床意义和应用价值。

技术领域

本发明涉及测序领域，尤其涉及用于基因检测的血小板核酸文库构建方法和试剂盒。

背景技术

癌症的早期诊断意味着可以提早治疗，对患者的预后及生存极其关键，是提高癌症生存率的最佳方法。以肺癌为例，肺癌是中国乃至世界范围内发病率和病死率最高的肿瘤，确诊时分期较晚是影响肺癌预后的重要原因，而早期肺癌可以通过多学科综合治疗实现较好的预后，甚至达到治愈的目的。目前，肺癌主要采用低剂量螺旋CT筛查，胸部增强CT、上腹部增强CT(或B超)、头部增强MR(或增强CT)以及全身骨扫描进行诊断和分期的基本策略。如果CT扫描显示有可疑的恶性特性，那么医生将会进一步采取组织活检的方法，对肿瘤组织取样进行病理诊断。

鉴于低剂量螺旋CT存在一定的电离辐射，筛查会增加较低的辐射致癌风险，指南建议高危人群每年接受一次低剂量螺旋CT筛查。而该方法还存在一定的假阳性，它会发现一些需要更多检查来确认的异常，而这些异常经证明并非癌症，这将同时增加受检者的生理和心理负担。因此，迫切需要一种风险更低的无创筛查和诊断方法。目前，癌症的无创筛查手段以肿瘤标志物为主，例如甲胎蛋白AFP、癌胚抗原CEA和CA199等，但其诊断的灵敏度和特异性较低，需同时选择多种肿瘤标志物联合测定，一般用于辅助诊断。

近年来，随着越来越多临床证据的出现，利用分子诊断技术指导患者个体化的精准治疗已逐渐成为共识。其中，液体活检作为体外诊断的一个分支，主要检测物包括血液中游离的循环肿瘤细胞(CTCs)、循环肿瘤DNA(ctDNA)和外泌体，其优势在于以非侵入性的取样方式大大降低了组织活检的弊端。然而，目前的检测物含量低且分离成本高，限制了检测方法的快速发展。正常机体中血小板主要通过释放和聚集功能，发挥促凝血以及促进伤口愈合的作用。在重大疾病如急慢性炎症或肿瘤的微环境中，可导致血小板特定的pre-mRNAs发生剪接，进而影响血小板的基因表达谱。此外，血小板是血液中第二丰富的细胞类型，获取方便，分离操作简单，可用作新的检测物。因此，对经过驯化的血小板如肿瘤驯化血小板(Tumor Conditioned Platelets)进行RNA检测，检测受检者是否罹患癌症，已成为一种新的液体活检方法。

中国专利申请201610911677.X公开了一种用于肿瘤早期筛查的肿瘤血小板RNA定量检测模型及方法，所述模型包括PCR检测特异性引物，用以临床诊断肿瘤血小板RNA生物标志物组合，包括CD79A、CD81、SYTL1、CENPC、TTN、RHOH、ZNF101、TRABD2A和TRAC。所述方法包括制备样本、提取RNA、逆转录、PCR检测、用算式计算Y值和结果评判。该专利使用RNA联合标志物诊断肿瘤的灵敏度能达到92.5％，高于目前临床常用生物标志物灵敏度。但该专利采用PCR定量的方法，一次只检测9个RNA生物标志物，只能区分癌症患者与健康人，无法进一步区分肿瘤类型。

中国专利申请201710731914.9公开了一种用于非小细胞肺癌诊断的血小板LncRNA的定量检测方法，证实NSCLC患者血小板长链非编码RNA MAGI2-AS3、ZFAS1的表达低于正常人，基于此制备出用于非小细胞肺癌诊断的实时荧光定量PCR的试剂盒。通过联合MAGI2-AS3和ZFAS1实时荧光定量PCR扩增获得的表达量数据，建立了非小细胞肺癌诊断的Logistic回归拟合数据模型，该模型对非小细胞肺癌有较高的诊断效能和敏感性。然而，该专利只检测血小板长链非编码RNA MAGI2-AS3和ZFAS1表达量，应用范围有限，只能用于非小细胞肺癌诊断，难以满足临床需求。

发明内容