[发明专利]槟榔坏死梭斑病毒及其检测方法

权利要求书

1.一种槟榔坏死梭斑病毒(Areca palm necrotic spindle-spot virus)，其特征在于，该病毒命名为槟榔坏死梭斑病毒ANSSV-Baoting，于2018年6月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：V201828。

2.一种如权利要求1所述槟榔坏死梭斑病毒的检测方法，其特征在于，针对病毒基因组中保守区域设计引物对，进行聚合酶链式反应，反应产物进行凝胶电泳检测，如果出现相应的核酸电泳条带，则判断为阳性，否则判断为阴性；其中，所述引物对为：

上游引物ANSSV 980F：5’-GATATACTCCACGTTGCAGATC-3’，

下游引物ANSSV 1720R：5’-CAGATGTCCCTTCACTTTCCATG-3’；或

上游引物ANSSV 360F：5’-ACAAGGATCTTGGAAAGATAGC-3’，

下游引物ANSSV 1120R：5’-CAGATGTCCCTTCACTTTCCATG-3’；

相应的核酸电泳条带为740bp或760bp。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，聚合酶链式反应的反应体系和反应条件如下： 在聚合酶链式反应管中依次加入纯水9.5微升、2×Taq PCR Mix聚合酶链式反应混合液12.5微升、所合成的浓度为10μmol/L的上游引物0.5微升、浓度为10μmol/L的下游引物0.5微升、需要检测的槟榔叶片总cDNA 2微升，其中，2×Taq PCR Mix聚合酶链式反应混合液含有0.1U Taq Polymerase/μl、500μM dNTP each、20mM Tris-HCl、100mMKCl、3mMMgCl 2、其他稳定剂和增强剂；

然后将聚合酶链式反应体系密闭进行聚合酶链式反应，反应条件步骤为：第一步，94摄氏度3分钟；第二步，94摄氏度30秒；第三步，52摄氏度30秒；第四步，72摄氏度1分钟；第五步，72摄氏度10分钟，其中第二步至第四步进行30个循环；

反应结束后，在反应产物中加入含有颜色的核酸电泳缓冲液，进行琼脂糖核酸凝胶电泳，若以ANSSV 360F和ANSSV 1120R为引物扩增，出现大小约760个碱基对的核酸电泳条带，则判断为阳性，否则判断为阴性；若以ANSSV 980F和ANSSV 1720R为引物扩增，出现大小约740个碱基对的核酸电泳条带，则判断为阳性，否则判断为阴性。

4.一种用于检测如权利要求1所述槟榔坏死梭斑病毒的引物对，其特征在于，所述引物对为：

上游引物ANSSV 980F：5’-GATATACTCCACGTTGCAGATC-3’，

下游引物ANSSV 1720R：5’-CAGATGTCCCTTCACTTTCCATG-3’；或

上游引物ANSSV 360F：5’-ACAAGGATCTTGGAAAGATAGC-3’，

下游引物ANSSV 1120R：5’-CAGATGTCCCTTCACTTTCCATG-3’。

5.一种用于检测如权利要求1所述槟榔坏死梭斑病毒的试剂盒，其特征在于，含有权利要求4所述的引物对。

6.如权利要求4所述的引物对在检测如权利要求1所述槟榔坏死梭斑病毒中的应用。

7.如权利要求4所述的引物对在制备用于检测如权利要求1所述槟榔坏死梭斑病毒中的试剂中的应用。