[发明专利]一步法RT-PCR预混试剂

说明书

本发明提供一种一步法RT‑PCR预混试剂，其特征在于，包括：RNA转录为cDNA的试剂，以及多聚糖。本发明将RT‑PCR反应所需酶、缓冲液等试剂预混在一个反应管中，节省了RT‑PCR操作时间，并且减少了反复开盖可能带来的污染。进一步，本发明通过添加多聚糖等试剂，增强了RT‑PCR反应效率。

技术领域

本发明涉及一种一步法RT-PCR预混试剂，属于分子生物学领域。

背景技术

反转录PCR(RT-PCR)以RNA为模板进行扩增，在基因表达水平的检测、RNA病毒含量检测以及直接克隆特定基因cDNA等方面有着广泛的应用。反转录PCR分为两个步骤，首先在反转录酶的作用下将RNA反转录为单链的cDNA，然后在DNA聚合酶的作用下将单链cDNA扩增为双链的DNA分子。RT-PCR过程可以分步进行，即在转录完成后去除酶、金属离子等对DNA聚合酶有抑制的组分，再加入DNA聚合酶和对应的缓冲溶液，也可以将反转录酶和DNA聚合酶混入一管中进行一步反应。同两步反应相比，一步反应降低了反复开盖带来的风险，因而更加便捷和安全。

要实现一步RT-PCR反应并不容易，一系列报道显示当反转录酶和DNA聚合酶在一管中进行反应时会相互干扰，引起RT-PCR灵敏度的降低。一方面这种抑制来自于反转录酶和DNA聚合酶最优缓冲液的不一致，另一方面多篇报道指出诸如鸟类成髓细胞白血病病毒反转录酶(AMV-RT)和小鼠白血病病毒反转录酶(M-MLV-RT)等会抑制DNA聚合酶的活力。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的一步法RT-PCR预混试剂，以增强一步法RT-PCR的反应效率。

本发明采用了如下技术方案：

一种一步法RT-PCR预混试剂，其特征在于，包括：RNA转录为cDNA的试剂，以及多聚糖。

进一步，本发明的一步法RT-PCR预混试剂：其中，RNA转录为cDNA的试剂包括：反转录酶、DNA聚合酶、缓冲液、辅因子以及表面活性剂。

优选的，本发明的一步法RT-PCR预混试剂，还具有这样的特征：其中，RNA转录为cDNA的试剂包括：反转录酶：M-MLV-RT或者AMV-RT，一种或者两种DNA聚合酶，5-100mM的Tris-HCl或者Tris-SO₄，1～10mM的MgCl₂，10～200mM的KCl，200～400μM的dNTP，5～40mM的DTT，10～400mM的海藻糖，0.2～3mg/mL的BSA，20～50mM的硫酸盐，甘油5～35％。

优选的，本发明的一步法RT-PCR预混试剂，还包括：SYBR染料，用以染料法RT-PCR过程。

优选的，本发明的一步法RT-PCR预混试剂，其中，硫酸盐为硫酸铵。

优选的，本发明的一步法RT-PCR预混试剂，其中，多聚糖为：水溶性葡聚糖。

优选的，本发明的一步法RT-PCR预混试剂，其中，水溶性葡聚糖的浓度范围是10-25mM。

优选的，本发明的一步法RT-PCR预混试剂，其中，水溶性葡聚糖的浓度是20mM。

优选的，本发明的一步法RT-PCR预混试剂，预混试剂的pH范围是8.3～9.2。

本发明还提供上述任意一项的一步法RT-PCR预混试剂在制备核酸检测试剂盒中的应用。

发明的有益效果

第一，将RT-PCR反应所需酶、缓冲液等试剂预混在一个反应管中，节省了RT-PCR操作时间，并且减少了反复开盖可能带来的污染。

第二，通过添加多聚糖等试剂，增强了RT-PCR反应效率。

附图说明