[发明专利]一种快速测定乳粉中致病菌的方法

说明书

本发明公开了一种快速测定乳粉中致病菌的方法，其包括以下步骤：S1、通过煮沸法提取乳粉中的核酸模板；S2、寡核苷酸引物的合成：查询沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌的特异保守基因，以此为靶基因设计、合成寡核苷酸引物；S3、荧光定量PCR检测：将核酸模板加入装有相应寡核苷酸引物对的小管中，再分别加入相应的荧光定量PCR试剂进行检测；S4、检测分析：分析检测数据。本发明的检测方法能够同时对乳粉中的多种致病菌(沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌)进行定量测定，检测方便快捷，重现性高，灵敏度高，检测时间短，准确率为98.78％。

技术领域

本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种快速测定乳粉中致病菌的方法。

背景技术

食品微生物检验方法是食品质量管理必不可少的重要组成成分，它是贯彻“预防为主”的方针，可以有效地防止或者减少人因食物而患病的情况发生，保障人民的身体健康。食品微生物检验是衡量食品卫生质量的重要指标之一，也是判定被检食品是否可食用的科学依据之一。通过食品微生物检测，可以判断食品加工环境及食品卫生情况，能够对食品被细菌污染的程度作出正确的评价，为各项卫生管理工作提供科学依据。因此，对于食品中致病菌的检测至关重要。

乳粉中的致病菌主要包括沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌，按照 GB29921-2013食品中致病菌限量规定，金黄色葡萄球菌限量为：n＝5，c＝1， m＝100CFU/g，M＝1000CFU/g(n为同一批次产品应采集的样品件数，c为最大可允许超出m值的样品数，M为致病菌指标的最高安全限量值)；沙门氏菌和志贺氏菌不得检出。

常规PCR可以实现对微生物尤其是致病菌的快速检测，但不能对待检的致病菌进行定量，而且一次实验只能检测一种致病菌，检测效率低；定量PCR可以对待检致病菌进行定量检测，但一次实验只能检测一种待检致病菌，不能实现对致病菌的高通量(同时)检测，检测效率较低。

发明内容

为了克服上述技术缺陷，本发明的目的是提供一种快速测定乳粉中致病菌的方法，该方法能够同时对乳粉中的多种致病菌(沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌)进行定量测定，检测方便快捷、准确、高效。

为了解决上述问题，本发明按以下技术方案予以实现的：

一种快速测定乳粉中致病菌的方法，包括以下步骤：

S1、乳粉中核酸模板的提取：

取25g待检乳粉加入营养肉汤中36℃培养24小时，取1mL培养液，加入到1.5mL无菌离心管中，6000-8000r/min离心5-10min，吸弃上清，加入50μLDNA 提取液，混匀后沸水浴5-10min，10000-12000r/min离心5-10min，取上清液作为核酸模板；

S2、寡核苷酸引物的合成：

查询沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌的特异保守基因，以此为靶基因设计、合成寡核苷酸引物；

S3、荧光定量PCR检测：

将步骤S1所得核酸模板分别加入装有步骤S2所得不同特异寡核苷酸引物对的小管中，再加入相应的荧光定量PCR试剂，在同一轮荧光定量PCR循环下，对乳粉中的沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌进行定量检测；

S4、检测分析：分析检测数据。

进一步的，在步骤S1中，取25g待检乳粉加入营养肉汤中36℃培养24小时，取1mL培养液，加入到1.5mL无菌离心管中，8000r/min离心5min，吸弃上清，加入50μLDNA提取液，混匀后沸水浴5min，12000r/min离心5min，取上清液作为核酸模板。

进一步的，步骤S2包括以下步骤：