[发明专利]一种地衣芽孢杆菌CRISPR-Cas9基因编辑系统及其应用

说明书

本发明涉及基因工程领域，尤其是涉及一种应用于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)2709的CRISPR‑Cas9基因编辑系统及其应用。所述基因编辑系统是以穿梭质粒pWH1520为载体，将所有调控元件构建于该载体上并经甲基化修饰后所得，所述调控元件包括由pS启动子控制的cas9蛋白、由pLY‑2启动子控制的sgRNA转录盒子，以及上、下游同源臂修复序列HA。所述基因编辑系统应用于地衣芽孢杆菌2709工业菌株存在效率高、设计简单、成本低等优点，基因敲除效率达到90.6％。

技术领域：

本发明涉及基因工程领域，尤其是涉及一种应用于地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)2709的CRISPR-Cas9基因编辑系统及其应用。

背景技术：

地衣芽孢杆菌是一类分布于土壤等自然环境的革兰氏阳性菌，已经被多个国际机构认定为GRAS(generally recognized as safe)工业菌株。由于地衣芽孢杆菌营养要求简单、极端环境抵抗能力强、产酶种类多、产量高、耐热性强、抑菌且安全无毒，被广泛应用于工业生产许多活性物质及酶制剂。随着生物技术的发展，尤其是基因编辑技术的发展，人们对地衣芽孢杆菌的认识不断提升，为满足实际生产需求，地衣芽孢杆菌的分子改造和遗传操作不断增多，相关工程菌被不断构建并成功应用。

基因组编辑技术作为新兴分子生物学技术，针对基因组中特定目的基因片段实现插入、删除、替换或修饰，在地衣芽孢杆菌的遗传改造方面发挥着极其重要的功能。但是传统的基因组编辑技术，如同源重组技术，效率极低(10^-6-10^-9)，且依赖于筛选标记，可能给宿主菌基因组带来不同程度的“疤痕”，极大地限制了其广泛应用。近年来发展起来的锌指核酸酶(Zinc finger nucleases，ZFNs)，类转录激活因子效应物核酸酶(Transcriptionactivator like effectornucleases，TALENs)为基因靶向修饰研究，提供了有效的技术手段；但由于其依赖蛋白和基因的相互作用，蛋白的组装繁琐，费时费力费钱，对实验室的技术要求仍是一个重大挑战，这严重制约着该类技术的应用与发展。此外，虽然地衣芽孢杆菌作为表达系统性能优良，但遗传操作困难，如遗传转化效率极低、可用载体少且稳定性差。以上原因阻碍了能有效应用于地衣芽孢杆菌基因编辑技术的开发。

CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeatsand CRISPR associated protein 9)是2012年发展起来的由RNA介导的基因编辑技术，其融合了经典遗传学和反向遗传学的研究思路，存在设计简单、效率高、重复性好和周期短等优势，可实现连续无痕的基因编辑，迅速发展为一种应用前景广阔的基因编辑工具。但是，应用于地衣芽孢杆菌的CRISPR/Cas9系统鲜有报道，现有技术的研究思路、使用载体和应用菌株等均有差异：见表1。本发明将为充分发挥CRISPR/Cas9先进技术的作用，完善该系统的应用范围，重要工业微生物的改造，做出积极贡献。

地衣芽孢杆菌发酵工艺和产物回收技术比较成熟，是良好的外源蛋白的分泌型宿主菌，具有很大的应用潜力。以往表达外源蛋白主要以枯草芽孢杆菌为主，但研究发现，作为蛋白表达宿主地衣芽孢杆菌比枯草芽孢杆菌有更多优势。地衣芽孢杆菌生长温度高，既节省生产能源，也可降低那些酶对结合在胞壁上的蛋白酶敏感性；此外，地衣芽孢杆菌生长速率适中，容易使刚跨膜的未合适折叠的蛋白充分折叠。作为表达外源基因的宿主菌，地衣芽孢杆菌提供了外源基因高效稳定的细胞微环境，表达产物较稳定，适合大规模工业化生产，且在酶产量方面，其比枯草芽孢杆菌更具优势，具有成为生产工业用酶宿主菌的巨大潜力。

发明内容：

本发明将提供一种应用于地衣芽孢杆菌2709的高效基因编辑系统——CRISPR/Cas9系统，有效解决该重要工业微生物的遗传改造困难的问题，显著提高其基因编辑的效率。