[发明专利]PDGF-BB对间充质干细胞释放的外泌体的影响

说明书

本发明涉及一种提高间充质干细胞分泌的外泌体的数量或性能的方法，所述方法通过在培养间充质干细胞时添加PDGF‑BB或者EPO/PDGF‑BB，使得MSC释放的外泌体数量增加，具有更强的促内皮细胞增殖能力和促血管新生能力。本发明为MSC外泌体应用于临床提供了有力工具。

技术领域

本发明涉及外泌体领域，尤其涉及PDGF-BB在改变间充质干细胞释放的外泌体的性能方面的应用。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)是一群具有成骨、成软骨和成脂肪功能的成体干细胞。MSC可通过旁分泌的形式，发挥调节免疫、促进血管新生和支持造血等功能。MSC来源丰富，存在于胎盘、脐带、骨髓、脂肪等多种组织中。因此，MSC作为一个药物，已经被多个国家批准，用于移植物抗宿主病、溃疡性结肠炎、心肌梗塞恢复期等疾病的治疗。然而无论静脉输注、肌肉注射或者心肌内注射，外源移植的MSC多在72h内死亡。那么，死亡的MSC又是如何发挥上述作用的呢？既往的研究表明，体外培养的MSC在低氧和血清撤除条件下，可以释放大量的外泌体。这种外泌体在体外可以促进内皮细胞增殖，促使内皮细胞形成毛细血管网状结构，加速缺血模型血流的恢复。事实上，MSC来源的外泌体已经进入临床试验阶段，用于糖尿病和肾功能不全的治疗。因此，MSC来源的外泌体作为“无细胞”细胞治疗的材料，具有潜在的实用价值。为提高治疗效果，探索获取具有更强功能外泌体的途径，对开展MSC外泌体的临床试验研究是十分必要的。

既往的资料表明，血小板衍生生长因子BB(platelet-derived growth factor-BB,PDGF-BB)是人MSC增殖必需的生长因子之一。红细胞生成素(erythropoietin，EPO)能促使MSC分泌肝细胞生长因子，而后者是已知的具有很强促血管新生的因子。因此，本文将探讨EPO和PDGF-BB是否能刺激MSC释放外泌体，以及这种外泌体是否具有更强的促血管新生功能。本文结果表明，EPO和PDGF-BB促使MSC释放功能更强的外泌体，为MSC来源的外泌体的临床试验研究，提供了有益的资料。

发明内容

本发明提供了一种提高间充质干细胞分泌的外泌体的数量或性能的方法，所述方法包括如下步骤：(1)将MSC悬浮于MSC无血清培养基中，接种于培养皿，培养过夜使细胞贴壁；(2)去除培养基，换用α-MEM培养基，仅加入PDGF-BB，或者同时加入PDGF-BB和红细胞生成素(EPO)，继续培养72h；(3)收集上清，离心去除细胞碎片，经滤膜过滤，离心收集沉淀，将沉淀悬浮于缓冲液中，即获得数量和性能提高的外泌体。

优选地，所述性能是指外泌体的促内皮细胞增殖能力和促血管新生能力。

优选地，其中步骤(1)中按照5×10⁶细胞/皿接种于培养皿。

优选地，其中步骤(2)中EPO的浓度为1U/ml，PDGF-BB的浓度为50ng/ml。

优选地，其中步骤(3)中去除细胞碎片的离心条件为1500g，30min，滤膜过滤后的离心条件为100,000g，离心1h。

优选地，其中步骤(3)中将沉淀悬浮于含5mmol/L KCl，1mmol/L MgCl2和136mmol/L NaCl的缓冲液中。

优选地，所述间充质干细胞是人脐带MSC。

本发明还提供PDGF-BB在提高间充质干细胞分泌的外泌体的数量或性能方面的应用，其中所述性能是指外泌体的促内皮细胞增殖能力和促血管新生能力。

本发明还提供PDGF-BB在制备提高间充质干细胞分泌的外泌体的数量或性能的试剂中的应用，其中所述性能是指外泌体的促内皮细胞增殖能力和促血管新生能力。

优选地，PDGF-BB和EPO同时使用。本发明具有以下积极效果：