[发明专利]两步基因组比较法设计贵州木霉NJAU 4742定量PCR特异性引物的方法

说明书

本发明公开了一种两步基因组比较法设计贵州木霉NJAU 4742定量PCR特异性引物的方法。本发明首先将NJAU 4742全基因组序列在NCBI和JGI数据库中比对，选出没有匹配的大于500bp的基因组片段，再将筛选得到的片段与同种菌株916的全基因组比对，设计出系列具独特碱基的引物序列。同时，还选用gfp标记菌株gfp‑NJAU 4742中插入的标记片段设计的三对引物作为对基于基因组设计的引物特异性的检验标准。通过同属不同种菌株扩增特异性检验、土壤添加再检测、盆栽土壤实际检测等步骤，筛选出最优的定量PCR引物。本发明的引物设计方法和设计的菌株特异性引物能够为其他菌株的定量PCR特异性引物设计和贵州木霉NJAU 4742的定量提供方法。

技术领域

本发明属于农业微生物领域，涉及对一株贵州木霉NJAU 4742的定量PCR技术的特异性引物的设计及应用。

背景技术

在过去的十几年中，对目标植物有利生长的研究中已经将大量功能性微生物菌剂直接接种到土壤中或与有机肥料结合作为土壤改良剂。因此，接种菌株在新环境中的存活在其功能表现上起着关键作用，因为有效的定殖是功能菌株刺激植物生长或对土壤微生物生态系统有利诱导的根本前提。

传统上选择性培养基多被用于检测或分离环境中的有益促生菌，然而，该方法灵敏度较低且耗时，并且对于形态上相似度极高的真菌种难以准确识别。基于DNA分析，定量PCR(qPCR)技术可以准确定量土壤中多种微生物的丰度，已成为当前分子生物学及微生物生态学研究和应用中使用最多的技术之一，其方法利用引物组定量扩增一段不含任何副产物(非特异性DNA)的特异DNA片段的拷贝，因此引物设计是qPCR中至关重要的一环。目前常用的引物设计必须首先寻找到具有特异性的序列(通常的做法是，从文献中获取物种特异性基因，并根据其保守的范围确定其通用性)，然而，从文献中获得的所谓“物种特异性基因”往往信息比较滞后，并未基于不断增长的基因组数据进行必要的更新，导致基于该基因序列获得的引物在实际应用中不一定能确保其特异性。有研究者基于木霉属共有的内部转录组间隔区(ITS)对木霉菌属设计引物且在不同的土壤中进行检测和定量；然而，这对于木霉种的区分是不够特异的。也有研究者利用SCAR标记技术能够对物种进行准确鉴定和监测，然而此分子方法基于对RAPD序列的分析，这是十分费时费力的过程。

木霉菌属的真菌在土壤中广泛存在，被认为是一种理想的生物防治剂，具有特定的生物防治机制，包括产生抗生素，具有竞争及诱导抗性等。同时，一些具有根际定殖能力的木霉菌株通过增加养分吸收以及刺激植物防御生物和非生物损害为植物生长提供直接或间接的促进作用。贵州木霉属于哈茨木霉菌种的亚种，贵州木霉NJAU 4742在国内已被广泛应用于商业生物制剂的固体发酵和生物肥料开发(专利申请号200910233576.1，CN201610003589.X和CN201610440785.3)。该菌株具有较强的促进植物生长的能力并含有多种优势基因。因此，探索来自功能性菌株贵州木霉4742的新型产品的开发以及通过定量PCR技术监测其在植物根系的动态变化，揭示其在农业生产实践的潜在促生机制尤为重要。

发明内容

本发明旨在针对现有实时定量PCR特异性引物设计技术的局限，提供一种两步比较基因组法，基于真菌特异性片段设计菌株特异性定量PCR引物的方法；并利用两步比较基因组法设计了贵州木霉NJAU 4742的菌株特异性定量PCR引物。

一种两步基因组比较设计贵州木霉NJAU 4742定量PCR特异性引物的方法；包括如下步骤：

(1)将NJAU 4742全基因组序列在NCBI和JGI数据库中比对，选出没有匹配的大于500bp的基因组片段，