[发明专利]石油污染厌氧环境中石油烃厌氧降解基因bamA含量的测定方法

说明书

本发明公开了一种石油污染厌氧环境中石油烃厌氧降解基因bamA含量的测定方法,方法以石油污染厌氧环境中烷烃、苯系物为目标降解组分，采用非培养的分子生物学技术实时荧光定量PCR对两种降解基因进行定量。方法主要包括DNA的提取，设计特异性扩增两种降解基因的简并引物，确定PCR条件，制作荧光定量PCR标准曲线，样品测定。本发明所述方法是一种能够检测厌氧条件下微生物降解石油烃活性的新型方法，同时能准确反映微生物的降解代谢途径和区域石油污染状况，在环境污染监测和治理方面有重要的应用价值。

技术领域

本发明属于环境石油污染监测技术领域，具体来说涉及一种石油污染厌氧环境中石油烃厌氧降解基因bamA含量的测定方法。

背景技术

近几十年来，随着石油工业的迅速发展，石油烃在土壤和水体中的污染已成为一个普遍的环境问题。好氧生物修复被认为是处理石油烃污染的有效方法。然而，有许多污染的场所如沉积物和地下水环境，通过提供氧气来刺激微生物的生长，非常困难而且成本高昂。近几年的大量研究表明，在缺氧或厌氧条件下同样可以进行石油烃的降解，这一新颖的观点对于石油污染土壤及地下水进行原位生物修复，特别是针对一些污染源较为分散、现场操作条件较差的石油污染区域来说具有很重要的作用。

烷烃是石油污染的主要成分，占50％以上。富马酸加成反应是大多数烷烃厌氧降解菌活化烷烃降解的关键步骤，催化酶是(1-甲基烷基)琥珀酸合酶(mas)。芳烃是一类最常见的地下水污染物。在厌氧微生物，大多数芳香族碳氢化合物(如单环芳烃、多环芳烃)都经过微生物作用形成中间体6-十六氧环烯基-CoA。该中间体的开环反应的关键酶是由bam基因编码6-十六氧环-1-烯-1-羰基CoA水解酶，bamA基因在降解芳香化合物的厌氧微生物中广泛存在。因此，将编码这两种关键酶催化亚基masD和bamA基因作为遗传标记，为研究石油烃降解菌在厌氧环境下的多样性和分布特征提供了一种方法。

运用分子生物技术实时定量聚合酶链反应(Real Time-qPCR)对石油厌氧降解基因的定量分析可以反映厌氧微生物修复石油污染的潜力。目前，运用荧光探针和荧光引物的定量PCR检测石油降解基因技术虽然特异性高，但操作复杂、成本高。Real Time-qPCR技术利用荧光信号积累对未知模板进行定量分析，具有高效率、高通量、高敏感性、易操作等优点，在治理油田污染土壤中具有重要应用价值。

发明内容

针对石油组分的复杂性和现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种石油污染厌氧环境中石油烃厌氧降解基因含量的测定方法。本发明采用SYBR Green I荧光染料RealTime-qPCR技术，建立一种对石油污染厌氧环境中烷烃降解基因masD及芳烃降解基因bamA的检测方法，确定最佳的Real Time-qPCR反应体系配方、引物浓度及最适的PCR升温程序。同时，对建立的Real Time-qPCR技术的灵敏性和重复性进行检验，并应用于氧化石墨烯促进石油烃厌氧降解中烷烃和芳烃降解基因的定量测定，对追踪石油污染物迁移及评价生物厌氧降解潜力具有重要意义。

本发明的目的是通过下述技术方案予以实现的。

一种石油污染厌氧环境中石油烃厌氧降解基因含量的测定方法，包括以下步骤：

1)获得能在厌氧环境中降解石油烃菌株的降解基因的DNA序列，根据降解基因的DNA序列利用Primer express软件遵循引物设计原则，设计出降解基因的简并性扩增引物的序列并合成该简并性扩增引物，其中，所述降解石油烃菌株的降解基因为masD或bamA；

在所述步骤1)中，通过Primer express软件得到：

在所述步骤1)中，通过Primer express软件得到：