[发明专利]一种适于双向电泳的水稻叶片质膜磷酸化蛋白的提取方法

说明书

本发明属于蛋白质组学技术领域，具体首次公开了一种适于双向电泳的水稻叶片质膜磷酸化蛋白的提取方法，包括水稻叶片粗质膜的提取、水稻叶片质膜的纯化及水稻叶片质膜磷酸化蛋白质的富集等步骤。本发明所述提取方法操作简单、提取效率高、成本低，所获的水稻叶片质膜纯度可达93%以上，从质膜蛋白质中富集的质膜磷酸化蛋白质得率为3.33～3.89%。该方法适合于质膜磷酸化蛋白提取困难、干扰杂质多的植物材料；同时所得质膜磷酸化蛋白杂质和干扰物较少，可满足双向电泳的要求，所获双向电泳图谱背景清晰、蛋白质点分布均匀、纵向拖尾和水平横纹现象较少，且具有良好的重复性；该方法适用于单子叶植物质膜磷酸化蛋白质组的制备与分析。

技术领域

本发明涉及蛋白质组学技术领域，具体地，涉及一种适于双向电泳的水稻叶片质膜磷酸化蛋白的提取方法。

背景技术

蛋白质磷酸化是指蛋白质在蛋白激酶作用下发生磷酸化，在磷酸酶的作用下去磷酸化。作为蛋白质翻译后修饰的最重要形式之一，蛋白质磷酸化调节着细胞内几乎所有的生命活动，尤其在调节细胞信号传导过程中起着极其重要的作用。磷酸化蛋白质组学是指采用蛋白质组学的分析方法，从整体上观察细胞中磷酸化蛋白质的修饰状态及其变化，进而分析特定磷酸化修饰对生命过程的调控作用及其分子机制；其内容主要包括磷酸化蛋白质的富集、检测、鉴定和定量等。其中，双向电泳(2-dementional gel electrophoresis,2-DE)技术仍是目前磷酸化蛋白质组学研究中最成熟最经典的蛋白分离技术，其研究策略是先对磷酸化蛋白质进行纯化和富集，再通过电泳技术等对磷酸化蛋白进行分离。2-DE技术具有高通量、高分辨率和良好的重复性等优点，可以清楚反映蛋白质点的分子量和等电点信息，是植物磷酸化蛋白质组学研究中最常采用的方法之一。

植物细胞质膜上存在识别外界各种胁迫信号和参与信号转导等功能相关的受体和早期反应蛋白，质膜蛋白质的磷酸化也被证实广泛参与了对外界胁迫(如病原菌等)的信号识别等反应；因此开展水稻细胞质膜磷酸化蛋白质的提取与纯化，有利于全面了解水稻磷酸化蛋白质组及功能磷酸化蛋白的筛选等。现有植物质膜磷酸化蛋白质组的研究中，大多采用的策略为：先分离纯化植物质膜，再将质膜蛋白进行酶解和磷酸化肽段富集，经过色谱分离和质谱分析，来开展蛋白质磷酸化修饰分析；其优点是肽段溶解性好、富集特异性高，缺点是蛋白质鉴定只依靠单一肽段容易造成混淆，难以直接确定蛋白质的分子量和等电点，并且非特异性吸附依然存在。

目前，尚未见水稻质膜磷酸化蛋白质组的相关报道，主要原因在于单子叶植物质膜难于纯化，且质膜磷酸化蛋白质丰度很低，质膜蛋白本身的疏水性容易导致蛋白质的丢失等。因此，研发一种适合于双向电泳分析的水稻质膜磷酸化蛋白质的分离技术体系非常必要。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有水稻质膜磷酸化蛋白质组分离纯化技术的空白，首次提出一种适于双向电泳的水稻叶片质膜磷酸化蛋白的提取方法，具体包括水稻叶片质膜的分离纯化、质膜蛋白质与Al(OH)₃孵育、非磷酸化蛋白质的清洗、磷酸化蛋白质的洗脱、丙酮沉淀等步骤，从而获得了高纯度的水稻叶片质膜磷酸化蛋白质。

本发明的另一目的在于提供一种用于水稻叶片粗质膜的提取缓冲液。

本发明的另一目的在于提供一种用于水稻叶片质膜磷酸化蛋白富集的缓冲液。

为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

由于磷酸化蛋白自身的一些特点，使得目前磷酸化蛋白质分析仍存在一些技术困难：首先，绝大多数磷酸化蛋白质在细胞中的丰度都很低；其次，磷酸化的可变性，使得在不同条件下蛋白存在不同的磷酸化形式；再次，现有的分析方法缺乏对磷酸化位点的动态分析，使得部分位点难以鉴定；质膜蛋白本身的疏水性容易导致蛋白质的丢失；最后，磷酸酶的存在使得在样品制备过程中产生脱磷酸化现象。因此，本发明针对上述问题，对现有磷酸化蛋白提取方法及制备过程中所用到的缓冲液和提取液进行了优化改进，使得最终富集到的质膜磷酸化蛋白的纯度大大提高，含有的杂质和干扰物较少，适合后续双向电泳分析。