[发明专利]一种RNA核酸释放剂及其应用

说明书

本发明公开了一种RNA核酸释放剂及其用应用，该RNA核酸释放剂含有摩尔浓度为0.35‑50mM的多果定、体积份数为1‑10％的聚乙二醇辛基苄基醚(TritonX‑100)、体积份数为1‑10％的乙基苄基聚乙二醇(NP‑40)、体积份数为0.1‑10％的Chelex‑100树脂和摩尔浓度为1‑200mM的醋酸钾，本发明以多果定代替胍盐或尿素，用于水煮法RNA提取，简化了RNA提取物在PCR之前的纯化过程，与使用胍盐或尿素进行RNA水煮法提取的方法相比较，使用该RNA核酸释放剂对RNA进行提取后扩增，在相同条件下，能够获得更好的扩增效果，降低了对初始检测样品中RNA浓度的要求。

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，具体涉及一种RNA核酸释放剂及其在水煮法提取RNA中的应用。

背景技术

自1869年Miescher发现核酸以来，涉及到核酸研究的分子生物学实验成为了最常见的实验之一。而核酸提取是研究核酸的重要手段。经过近150年的探索研究，已有多种核酸提取的方法被报道。核酸提取主要包括DNA提取和RNA提取。

关于DNA的提取，最经典的方法为碱裂解法提取质粒DNA。该方法提取的DNA纯度好，得率高，合适大部分分子生物学实验。但是，该方法提取过程繁琐，耗时较长，需要用到苯酚氯仿等毒害性较高的化学试剂。为了改进碱裂解法中出现的弱点，有大量的研究根据不同的分子生物学实验，针对性开发出更加简便高效的核酸提取方法。比如目前提取DNA通常采用水煮法，通过水煮10-20分钟裂解样品，利用乙二胺四乙酸(EDTA)、Chelex-100树脂等螯合剂螯合掉样品裂解后所释放的干扰后续PCR反应的金属离子，从而得到可用于PCR反应的DNA。水煮法具有简便、易操作、核酸提取率高等特点，广泛应用于疾控、法医等领域。

关于RNA的提取，由于RNA酶具有一定的稳定性，而且来源广泛，RNA提取常会受到RNA酶的污染而失败。现行RNA提取常用异硫氰酸胍或盐酸胍法。该类胍盐具有溶解蛋白质，导致细胞结构和核蛋白二级结构破坏，使蛋白质从核酸上解离下来的功能。此外，RNA酶活性可被胍盐有效抑制。RNA提取实验中广泛使用的Trizol试剂，即为胍盐配合吐温、苯酚等试剂配制而得。另外，在专利CN105441425A中，李文娴通过RNA酶抑制剂(尿素和氧钒核糖核酸复合物中的一种或几种)、阳离子螯合剂(EDTA、8-羟基喹啉螯合树脂、聚苯乙烯吡啶树脂、Chelex-100树脂、壳聚糖改性树脂、冠醚树)，同时结合水煮方式，对RNA提取过程进行了简化。但该方法裂解力度较温和，且尿素对RNA酶的抑制作用较弱，仅能对高浓度的RNA样本进行裂解和提取。

中国专利公布CN103068979A公开了一种用于从包含DNA和RNA的生物样品中提取RNA的溶液，该溶液包含相对于溶液的总量超过50％(V/V)的酚、相对于溶液总量为3-10％(V/V)的多元醇、相对于溶液总量为0.5-2.0M浓度的胍盐、相对于溶液的总量为0.1-0.5M浓度的硫氢酸盐和用于将溶液的pH值维持在4-6的缓冲剂。虽然，胍盐的使用，极大提升了RNA提取的成功率，但是，胍盐对逆转录酶或者DNA聚合酶活性具有严重的抑制作用。用胍盐法提取的RNA必须经过严格的胍盐去除步骤，才能应用于下游的分子生物学实验。这些繁琐的步骤，在一定程度上阻碍了分子生物学实验的快速、顺利开展。而通过阳离子螯合剂结合水煮方式提取RNA，虽然操作步骤简便，但是由于该方法裂解力度较温和，不能有效对样本进行完全裂解，导致RNA提取得率较低，也不利于下游分子生物学实验开展。

本发明提供一种可以传承胍盐提取RNA优点，同时能减弱对逆转录酶或者DNA聚合酶活性抑制的，可以取代盐酸胍或异硫氰酸胍的试剂，多果定(Dodine)。多果定又名十二烷基胍醋酸盐(结构如化学式I所示)，是一种含胍基的特殊表面活性剂。本发明，以多果定，代替传统的胍盐(异硫氰酸胍或盐酸胍)的使用，结合水煮法，能快捷、有效地对样本进行裂解，释放其中的RNA，同时保护已释放的RNA不被样本中未分离纯化掉的RNA酶降解。由于残留在RNA样本中的多果定对逆转录酶或者DNA聚合酶活性等抑制较小，所提取的RNA样本无需经过严格的纯化即能进行下游的qPCR(实时荧光定量PCR)实验。