[发明专利]一种病原体DNA核酸释放剂

说明书

本发明公开了一种病原体DNA核酸释放剂，本发明通过使用多果定代替传统的胍盐和一部分去污剂的使用，有效地对含有病原体的血清样本进行裂解，释放其中的核酸，并降低对下游实验的抑制，从而显著的提高了病原体的裂解效率，并大大缩短了检测时间，同时病原体DNA充分释放且本身不干扰后续PCR的扩增。本发明不需要像传统的核酸提取试剂盒一样进行裂解、洗涤、洗脱等繁琐的提取步骤，极大提高实验室工作效率，并有效避免了实验操作过程中可能发生污染的环节，同时还减少医疗废弃物的产生。

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，具体涉及一种病原体DNA核酸释放剂。

背景技术

现阶段血浆中游离的病毒颗粒可通过PCR方法进行定量，由每毫升血浆的病毒DNA拷贝数表示，实时荧光定量PCR是现在临床最先进的检测方法，该方法目前已相当成熟，然而用于检测前的提取步骤却十分繁琐，裂解、多次洗涤、洗脱等，不仅耗时，且极易污染，同时会产生较多的废弃物，不利于绿色环保。

核酸提取是下游核酸检测、研究或者产品研发的起点，所分离的核酸的质量、纯度和完整性直接影响研究或诊断结果，因此在病毒检测领域，核酸释放剂起着非常重要的作用。理想的核酸释放剂获得的核酸没有蛋白、脂或其他核酸的污染，目前已经有很多专业化的核酸释放剂可以从生物样品得到目的核酸。

如中国专利201510446386.3公开了一种利用微量核酸释放剂提取生物样本中病毒DNA的方法，微量核酸释放剂裂解生物样本(血清或血浆)中病毒DNA同时，佐以促释放剂能更有效地保证裂解、释放效率，微量核酸释放剂在完全释放核酸的同时，还具有封闭样本中对PCR扩增具有干扰作用的蛋白质、药物及溶血等各种因素物质的功能，避免检测过程的假阴性，使得样本提取简便、灵敏、快速，但本发明要经过洗涤的步骤，在洗涤的过程中容易造成核酸丢失，降低了检测的准确性。

目前如广泛存在的HBV病毒(乙型肝炎病毒)，全球乙型肝炎病毒感染者已超过二十亿，无论对于患者还是医生，都需要及时知道有无感染或是治疗效果评估，以不错过最佳治疗或用药时间。因此需要一种能满足乙肝快速筛查和临床诊疗检测等需求的、又快又准的临床诊断产品。

虽然HBV DNA的荧光定量检测方法，已经是一种相对成熟的临床检测方法，但是该方法具有一些缺点，如操作步骤较多，不仅耗时较长，而且易污染，同时会产生较多的废弃物，不利于环境的保护。另外，提取试剂引入的抑制剂，以及洗涤步骤中HBV DNA的损失，都会降低试剂的检出性能。

申请人多年一直致力于HBV检测试剂盒的研究，已有HBV检测类的发明专利201410223058.2，其公开了检测乙型肝炎病毒的PCR引物、引物组、探针以及试剂盒和检测方法，该发明可检测出世界范围内各种不同亚型的乙型肝炎病原体，在血清标本中定量检测限可达2IU/mL。但该发明采用的DNA裂解液为常规裂解液，操作相对不够简单，耗时相对较长。

市面上也有如湖南圣湘生物的一步法的HBV荧光定量方法,如中国专利200910309980.2公开了一种一步法病原体核酸荧光定量PCR检测方法，针对待测病原体核酸选取保守基因序列，设计特异性引物探针，采用一种核酸快速释放试剂提取病原体核酸，直接加入相应的PCR反应液，实现PCR荧光定量检测，该发明操作简单快速，抗污染抗干扰能力强，提取的核酸无损失，所用试剂制造成本低，但无法对血清中低至20IU/mL的HBV DNA进行准确定量。

同样，在近些年PCR(RT-qPCR)已经应用于细胞相关HIV病毒的定量，这种方法具有很高的特异性，但在抗逆转录病毒治疗后，为了能够检测到微量的核算病毒，检测手段的敏感性还需要加强，目前同样需要一种可以精确检测微量病毒拷贝的方法。

多果定(十二烷基胍醋酸盐，Dodine)，是一种含胍基的特殊表面活性剂，主要作为日化用品类表面活性剂，防治果树、蔬菜病害，多果定可用来防治果树、蔬菜、坚果、观赏植物和成荫树上的多种主要霉菌病害。此外，用于工业水处理剂，洗涤剂，种子处理剂和妇女儿童用品等。