[发明专利]一种里氏木霉及其在单宁酶生产中的应用

说明书

本发明涉及一种高产单宁酶的突变菌株里氏木霉，已于2018年6月21日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2018389。本发明还提供了所述里氏木霉突变株在生产单宁酶中的应用。所述里氏木霉突变株能大幅度提高单宁酶的表达量，20L罐发酵160h后，突变菌株发酵上清液中单宁酶酶活高达158u/ml，比出发菌提高了56.4％，取得了意料不到的技术效果。所述里氏木霉突变菌株可广泛应用于单宁酶的生产，从而有利于降低单宁酶的生产成本，促进其在食品和饲料加工等领域中的推广与应用。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体内容涉及一种里氏木霉及其在单宁酶生产中的应用。

背景技术

单宁酶全称是单宁酯酰水解酶(Tannase,EC 3.1.1.20)，它可以水解没食子酸单宁中的酯键和缩酚羧键，生成没食子酸和葡萄糖。单宁酶在自然界中分布相当广泛，有关单宁酶较早的报道是20世纪20年代，Freudenberg在进行黑曲霉培养时发现在其菌丝中含有单宁酶，以后又发现各类微生物，包括真菌、酵母、细菌都能可产生单宁酶；单宁酶还存在于一些植物材料中，例如茶叶提取物。单宁酶可广泛应用于食品工业、精细化工等领域。

在液态茶和速溶茶的生产中，由于多酚类、咖啡碱、蛋白质等物质生成络合物，形成所谓的“冷后浑”，因此需要进行“转溶”工艺。单宁酶就是酶法转溶的专一酶。它能断裂儿茶酚与没食子酸间的酯键，使苦涩味的酯型儿茶素水解，释放出的没食子酸阴离子又能与茶黄素、茶红素竞争咖啡碱，形成分子量较小的水溶性短链物质，从而降低茶汤的混浊度。单宁酶应用于红茶、绿茶、乌龙茶深加工中,还能使茶叶中可溶性金属元素含量增加。随着单宁酶在茶饮料业中的应用越来越广泛深入,美国食品与药物管理局(FDA)已确认单宁酶为安全产品。

单宁酶还可用于啤酒和果汁的澄清、防止果酒和果汁中酚类引起的变质、咖啡风味的软饮料生产、麦芽多酚的稳定处理、葡萄酒风味的改进等方面。韩国科学家Chae Soo-Kyu和Yu Tai-Jong用单宁酶处理橡实，使之可以食用；还将米粉与橡实粉1:1混合，再经淀粉酶和单宁酶作用后可用于酿造橡实果酒。单宁酶还可用来除去天然食品中因单宁而引起的苦涩味。

此外，单宁酶还广泛应用于饲料工业领域。来源于植物的饲料往往含有单宁，它可以使植物蛋白以及家畜自身所分泌的消化酶蛋白凝固沉淀，从而减少家畜对摄入蛋白的消化率和增加粪便排泄中的氮源。因此，在饲料加工过程中如用单宁酶进行相应处理，将大大提高家畜对植物蛋白的利用和吸收率，降低畜牧业的生产成本。Viveros A等研究发现，在对家鸡投放的豆类更壳饲料中添加单宁酶，将显著地增加鸡肉的获取量。

单宁酶主要是由微生物生产的，能够产生单宁酶的菌种十分丰富，除了传统的青霉、曲霉、酵母，还有巴斯德菌、寄生内座壳菌、绿色木霉和茄形镰刀菌等。目前，市售的单宁酶产品种类比较少，而且因生产菌株产量较低，导致该酶的价格居高不下，严重限制了该酶在食品、饲料等领域的广泛应用。因此，开发高产单宁酶的生产菌株迫在眉睫。

发明内容

本发明为解决现有技术问题，提供了一种高产单宁酶的里氏木霉(Trichodermareesei)菌株。申请人首先构建得到重组表达单宁酶的里氏木霉工程菌株，然后通过紫外诱变的方法筛选获得一株单宁酶产量得到显著提高的突变菌株，可广泛应用于单宁酶的生产。

本发明一方面提供了一种里氏木霉工程菌株，所述菌株携带有用于重组表达单宁酶基因的重组质粒。

所述单宁酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，其编码核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

本发明一方面提供了一种突变菌株里氏木霉4QT2(Trichoderma reesei 4QT2)，已于2018年6月21日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2018389。

本发明还提供了所述里氏木霉突变株在生产单宁酶中的应用。