[发明专利]一种由犬白蛋白、犬干扰素γ和犬白细胞介素2组成的融合蛋白及其制备方法

说明书

本发明公开了一种由犬白蛋白、犬干扰素γ和犬白细胞介素2组成的融合蛋白及其制备方法，所述融合蛋白由犬白蛋白、犬干扰素γ和犬白细胞介素2经柔性linker连接而形成，融合蛋白与冻干保护剂混配后经冷冻干燥即可得到重组犬长效干扰素。所述重组犬长效干扰素可显著提高犬干扰素的半衰期，较普通犬干扰素的半衰期提高18倍以上，并具有广谱抗病毒作用并能提高犬自身的免疫应答。

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，具体涉及由犬白蛋白、犬干扰素γ和犬白细胞介素2组成的融合蛋白及其制备方法。

背景技术

根据中国宠物行业现状分析，截止到2014年末我国宠物行业的市场规模已经达到1058亿人民币，而中国宠物医疗行业目前仅占约20％，相比较宠物行业相对成熟的美国市场，其宠物医疗的产值比达到50％，中国宠物医疗行业存在巨大的发展空间。

犬是人类忠诚的朋友，随着国内宠物犬等犬类饲养数量的大幅度增加，犬类疾病发病率、死亡率的不断升高，给人类造成精神和经济上的双重损失。犬与人类亲密接触导致人类被犬病毒感染的几率极高，如狂犬病毒、犬细小病毒和犬瘟热病毒等，都会给人类健康带来极大的威胁。

据相关科学研究报道干扰素作为一类重要的细胞因子，在对犬瘟热、犬细小病毒病、犬传染性肝炎和犬冠状病毒病等疾病的治疗中均具有一定的疗效。因此积极研究干扰素在犬病毒性疾病治疗中具有广阔的应用前景。

IFN是一类病毒感染诱导机体产生具有广谱抗病毒、抗肿瘤和具有免疫调节作用的蛋白质，1957年Issacs和Lindeman首先发现，它是一类多功能的细胞因子，与细胞受体结合后，可诱导机体产生多种特异性蛋白质和酶类，主要通过抑制病毒基因转录和降解病毒RNA来抑制病毒的生长繁殖以及发挥抗肿瘤等的活性。现已知，γ型IFN是由激活的T细胞和NK细胞产生，具有较强抗病毒和免疫调节功能。大量研究表明，干扰素γ除了具有广谱抗病毒功能外，对免疫系统也起着关键的调节作用，所以IFN-γ又称为免疫调节干扰素。虽然各种类型的干扰素均能够介导细胞对病毒感染的反应，但干扰素γ的免疫调节活性在协调免疫反应和确定机体长期的抗病毒状态中发挥更为重要的作用，因此干扰素γ具有极为重要的临床应用价值。

细胞因子IL-2即白细胞介素2，又名T细胞生长因子。主要由活化的T淋巴细胞产生的具有广泛生物活性的细胞因子，既可以促进淋巴细胞增殖，增强免疫功能，又能限制T细胞反应而增强机体的免疫耐受，故可用于治疗肿瘤、感染性疾病和自身免疫性疾病。在兽医中，由于IL-2能提高疫苗的免疫应答和减少疾病的发生，也出现广阔的应用前景。IL-2因能增强机体的免疫水平，提高机体的抗病能力，因而用于细菌性、病毒性和寄生虫性疾病的免疫治疗。此外，IL-2还可影响药物的代谢，使药物的代谢时间延长，作用时间增加，从而提高药物疗效。IL-2与其他细胞因子根据基因构建，组成融合蛋白，以增强疫苗的抗体产生和提高细胞免疫水平。

血清白蛋白是血浆的重要成分，正常情况下不易透过肾小球，体内分布极广而且没有酶学和免疫学活性，是理想的药物载体。白蛋白融合技术有以下优点：白蛋白与目标蛋白在细胞内经蛋白翻译系统通过肽键链接，不需额外的体外处理；白蛋白的表达水平较高，与其融合后可以提高目的蛋白的表达水平；白蛋白是一个稳定的“惰性蛋白”，与其融合后可以提高目的蛋白的稳定性；白蛋白融合蛋白具有较长的药物半衰期，将小分子蛋白药物与白蛋白融合可有望提高在血液中的半衰期。目前，多种蛋白与白蛋白融合后在实验动物体内半衰期的延长得到了证实。

天然干扰素及人工重组干扰素目前普遍存在半衰期短的局限，半衰期一般为2-4个小时。半衰期短给治疗带来了极大的不便，治疗次数的增加，相应的时间成本及经济成本随之增加，而机体的耐受极限也有可能被突破导致不良反应的产生。半衰期短的主要原因有两个：干扰素的分子量过小在体内代谢过快，干扰素尤其是重组干扰素亲和力较差被免疫系统清除。而市面上常见的长效干扰素以聚乙二醇融合干扰素为代表，仅在分子量的层面上部分解决了干扰素分子量小而导致半衰期短的问题。