[发明专利]一种用于肝癌早期筛查的试剂盒及其使用方法

说明书

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种用于肝癌早期筛查的试剂盒及其使用方法。本发明首次发现SCAND3可作为用于检测肝癌的甲基化标志物。检测SCAND3甲基化的引物序列如下：正向引物序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物序列如SEQ ID NO.2所示；所述荧光探针序列为SEQ ID NO.3，探针5′端标记FAM，3′端标记MGB。本发明以SCAND3为用于肝癌早期筛查的甲基化标志物，用于肝癌诊断，具有灵敏度高和特异性强的优点，尤其是在AFP＜400μg/L患者中，SCAND3甲基化发生率高达60％；由此可知，本发明以SCAND3为甲基化标志物，适用于肝癌的诊断，尤其适用于早期肝癌的诊断。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种用于肝癌早期筛查的试剂盒及其使用方法。

背景技术

肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是威胁人类生命常见的恶性肿瘤之一，而多数原发性肝癌患者早期症状不明显，确诊时大多数患者已经达到中晚期，因此实现早期诊断、获得根治性切除是患者长期生存的唯一希望。由于缺乏特异性的肿瘤标志物，多数患者确诊时已属晚期，丧失了根治性切除的机会。

目前，肝癌诊断方法包括影像学检查、病理学检查及实验室检查。但早期肝癌影像学表现不典型，且部分检查具有辐射性及价格昂贵的缺点。肝穿刺活组织检查是诊断HCC的金标准，但早期肝癌病灶小，穿刺活检难度大，且具有一定程度的创伤性，不易被患者接受。肿瘤标志物检测对肝癌影像学及病理学诊断具有重要的补充价值，并且通过监测肝癌标志物，能比其他方法提前发现肿瘤或肿瘤的复发、转移，提高预测和诊断的准确性，从而提高疗效，改善预后。在原发性肝癌诊断中，临床应用最广泛的肿瘤标志物是甲胎蛋白(AFP)，但其诊断敏感性和特异性不太令人满意，诊断肝癌的灵敏度和特异度分别为41％～65％和80％～94％。

近年来的研究发现，肿瘤患者外周血浆中存在游离的肿瘤DNA，并且具有与肿瘤细胞DNA相同的基因改变，因此检测肿瘤患者外周循环DNA为肿瘤的早期微创诊断提供了新的手段。

AFP仍是临床应用最为普遍的诊断肝癌的肿瘤标志物，其以400μg/L为临床诊断肝癌临界值；AFP≥400μg/L时，诊断率较高；而对于部分早期、可切除患者，即AFP＜400μg/L易被漏诊。因而，寻求灵敏度和特异度更高的肿瘤标志物对肝癌的早期诊断具有重要意义，尤其对AFP＜400μg/L患者。

发明内容

本发明主要目的是，提供一种用于肝癌早期筛查的试剂盒及其使用方法。本发明首次发现SCAND3的甲基化程度与肝癌发生相关，并且可通过检测外周血中SCAND3甲基化程度，用于肝癌的早期检测和诊断。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明目的之一，提供一种用于肝癌早期筛查的甲基化标志物，所述甲基化标志物为SCAND3。

本发明目的之二，提供以上所述的甲基化标志物在制备肝癌早期筛查诊断试剂中的应用。

本发明目的之三，提供一组用于检测以上所述甲基化标志物的引物及探针，所述引物序列如下：正向引物序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物序列如SEQ ID NO.2所示；所述荧光探针序列为SEQ ID NO.3，探针5′端标记FAM，3′端标记MGB。

本发明目的之四，提供以上所述的引物及探针在制备用于肝癌早期筛查的试剂盒的应用。

本发明目的之五，提供一种试剂盒，包括以上所述的引物及探针，还包括检测GAPDH的正向引物及探针，PCR Master Mix，裂解液，蛋白酶K，漂洗液，亚硫酸氢盐溶液和ddH₂O。

本发明目的之六，提供以上所述试剂盒的使用方法，步骤如下：