[发明专利]重组L-门冬酰胺酶及其制备方法和用途

说明书

本发明涉及生物制药、生物化学和药物的适应症领域，具体涉及重组L‑门冬酰胺酶(重组L‑asp)的制备方法和在制备抗白血病药物中的应用。本发明利用改良的脉冲稀释法纯化的L‑门冬酰胺酶纯度为90.14％，产率为5.23mg/L，酶的比活性为201.21IU/mg。细胞水平的活性显示：作用48h后，L‑门冬酰胺酶对Jurkat和Raji细胞的IC50分别为4.15IU/mL和4.65IU/mL；作用72h后，L‑asp对Jurkat和Raji细胞的IC50分别为2.40IU/mL和2.01IU/mL。基于以上结果，本发明提供了一种高效的重组L‑asp的制备方法并且也提供了重组L‑asp在制备抗急性白血病药物中的应用。

技术领域

本发明涉及生物制药、生物化学和药理学领域，具体涉及重组L-门冬酰胺酶及其制备方法和用途。

背景技术

重组L-门冬酰胺酶(L-asp)作为国内外临床上治疗急性白血病(ALL)最有效的药物，其药物治疗缓解率在50％以上，药物缓解期为1～9月，对急性粒细胞白血病和急性单核细胞白血病也有一定疗效。同时，L-asp具有缓解期短、易产生耐受性的特性，因而目前在治疗过程中多数也会与其他抗癌药物联合应用。L-asp已经上市50多年，但其副作用及较短的药物半衰期仍是限制其临床使用的重要因素。人源白蛋白(Human Serum Albumin,简称HSA)是人体含量最多的蛋白质，在体内承担很多物质的储存和运输。研究表明，白蛋白能够作为药物载体，使得药物缓慢释放从而显著提高药物的半衰期，如氨甲喋呤和阿霉素等使用白蛋白作为载体进行改造均发现药物的半衰期得到显著提高。此外，多数药物与HSA自身存在较强的亲和力，结合人体HSA含量较高的特性，对自身与HSA结合能力弱的药物使用HSA作为药物载体或许可以提高这类药物的半衰期。

本发明构建了一种新的重组L-asp并建立了重组L-asp的制备方法，对重组L-asp的性质进行了表征，重点对重组L-asp与HSA的亲和力进行检测，本发明通过蛋白质工程改造显著提高了L-asp的半衰期。

发明内容

本发明采用改良脉冲稀释法纯化重组L-门冬酰胺酶，对纯化所得蛋白采用奈氏试剂法测其酶活，动态光散射检测重组L-门冬酰胺酶粒径分布，微量热泳动检测蛋白与人源白蛋白的结合能力，CCK-8在细胞水平检测重组蛋白对淋巴癌细胞以及对正常细胞的的杀伤作用，最后对重组L-门冬酰胺酶体外血浆半衰期进行检测。

改良的脉冲稀释法纯化的重组L-门冬酰胺酶蛋白纯度为90.14％，产率为5.23mg/L，酶的比活性为201.21IU/mg。重组蛋白的平均粒径为6.25±0.16nm，且分布均匀。细胞水平的活性显示：作用48h后，L-asp对Jurkat和Raji细胞的IC50分别为4.15IU/mL和4.65IU/mL；作用72h后，L-asp对Jurkat和Raji细胞的IC50分别为2.40IU/mL和2.01IU/mL。在L-asp实验浓度范围内，作用24h、48h、72h后，L-asp对HBE细胞作用微弱、无法计算出IC50。重组L-asp蛋白与HSA的结合kd值为14.15μM，体外血浆半衰期为25h。

本发明提供了一种重组L-门冬酰胺酶的表达和纯化方法，脉冲稀释法纯化所得蛋白纯度和酶活均较高，重组蛋白粒径均一，在缓冲液中未形成积聚体，重组L-asp蛋白对淋巴癌细胞杀伤作用强，对正常细胞的细胞毒作用较弱，与HSA有一定的结合能力，体外血浆半衰期为25h。

本发明提供了一种高效的重组L-asp的表达纯化方法，所获得的重组L-asp可以用来制备治疗急性白血病的药物。

附图说明

图1重组L-asp纯化结果。

图2重组L-asp的粒径分布情况。