[发明专利]一种通过基因编辑创制抗番茄黄化曲叶病毒病番茄新种质的方法及其应用

权利要求书

1.一种通过基因编辑创制抗番茄黄化曲叶病毒病番茄新种质的方法，其特征在于：通过对Ty-5外显子区域进行基因编辑，利用植物自身对DBS的修复机制，引入DNA序列的缺失，使Ty-5基因功能的丧失，从而获得对TYLCV的抗病性。

2.根据权利要求1所述的通过基因编辑创制抗番茄黄化曲叶病毒病番茄新种质的方法，其特征在于：利用CRISPR/Cas9技术对Ty-5的基因编辑。

3.根据权利要求2所述的通过基因编辑创制抗番茄黄化曲叶病毒病番茄新种质的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)gRNA靶位点的选择

gRNA靶位点选择在Ty-5基因的外显子区域，根据CRISPR/Cas9靶位点锚定原理，选取原型间隔序列毗邻基序上游18-20bp碱基作为靶位点，即5'-N18-20NGG-3'，NGG为PAM序列，N18-20代表18-20bp碱基的识别序列；

(2)根据识别序列设计oligo序列引物：

Target-Sense：5’-TTG-NNNNNNNNNNNNNNNNNNN，其中，N表示gRNAsense序列；

Target-Anti：5’-AAC-NNNNNNNNNNNNNNNNNNN，其中，N表示gRNAsense的反向互补序列；

将引物浓度稀释为10μm，取上述引物各5μL，加水15μL，混匀；95℃放置3分钟，之后慢慢冷却至25℃，之后16℃5分钟，完成oligo二聚体的合成；

(3)CRISPR/Cas9重组载体的构建及农杆菌转化

选用北京唯尚立德生物科技有限公司的CRISPR/Cas9试剂盒VK005-14，利用已合成的oligo二聚体1μL，Cas9/gRNA载体1μL，Solution和Solution 2各1μL，H20加入6μL混合均匀，16℃反应2h；

将连接后的载体转入大肠杆菌感受态，挑取单克隆进行质粒测序分析，测序引物为sqprimer：5’-GATGAAGTGGACGGAAGGAAGGAG-3’，如SEQ IN NO.5所示，将测序结果阳性的质粒，转入农杆菌GV3101；

(4)番茄转化

以番茄子叶为外植体，通过叶盘法进行番茄再生，用阳性农杆菌GV3101介导番茄转化，经过潮霉素抗性筛选，获得再生番茄植株。

4.根据权利要求3所述的通过基因编辑创制抗番茄黄化曲叶病毒病番茄新种质的方法，其特征在于，还包括以下步骤：

(1)再生植株基因编辑检测：根据靶位点上下游序列，设计可以扩增靶位点的引物，提取再生植株DNA，以其为模板进行PCR扩增，对扩增产物进行测序，对再生植株的是否发生基因编辑，以及编辑类型是否为纯合突变进行测序分析；

(2)抗性鉴定：测序分析后，纯合基因编辑类型的株系进行TYLCV的接种鉴定。

5.权利要求1-4任一所述的通过基因编辑创制抗番茄黄化曲叶病毒病番茄新种质的方法在番茄育种中的应用。