[发明专利]一种高通量的单细胞转录组测序方法和试剂盒

说明书

本申请公开了一种高通量的单细胞转录组测序方法和试剂盒。本申请的高通量单细胞转录组测序方法，包括采用液滴生成系统将单细胞与带有标签的微珠包裹在一个液滴中，并在液滴中进行逆转录。本申请的方法，通量可达9000个细胞，与10×genomics相当，液滴破乳之后微珠相互污染小，提高了有效数据占比。本申请的方法在液滴中进行逆转录，所需试剂少，成本低。本申请的优选方案中，逆转录采用SMART模板转换技术，其产物可以直接用于后续的Tn5文库构建以及BGISeq‑500平台测序，无需进行文库转化；避免了多次扩增引入偏差，实现了液滴微流控平台与BGISeq‑500测序平台连用，简化并方便了大规模单细胞测序。

技术领域

本申请涉及单细胞测序领域，特别是涉及一种高通量的单细胞转录组测序方法和试剂盒。

背景技术

疾病发生机制和他们的检测预防主要是通过对细胞基因组变异、转录组异常表达的检测来进行分析。而单细胞测序技术能够揭示组织内细胞复杂的异质性，为疾病的诊断和治疗提供精准的信息。受制于单细胞测序技术的处理通量和成本等问题，很多大规模的研究工作无法展开，微流控技术和单细胞测序技术相结合可以很好地解决这些问题；同时单分子测序技术能够避免核酸扩增所引起的误差，在基础科研和临床医学研究中具有极大的应用前景和需求。

美国Fludigm公司于2014年推出的C1单细胞全自动系统，该仪器通量已提升到一次可以分析数百个单细胞。该系统的出现成为全世界单细胞研究课题组关注的焦点。但是，Fluidigm的C1系统，使用微阀区分单细胞，由于芯片上的腔室有限，通量较低，目前最多只能做938个细胞，且成本高。

Wafergen系统，使用微孔芯片和机械臂实现单细胞的分离，微孔数量72*72，相对于Fluidigm的C1系统，Wafergen系统通量可以达到1000-2000个细胞；但是，通量仍然较低，不能很好的满足大规模研究工作的使用需求；而且，Wafergen系统反应体系庞大，导致消耗试剂多、成本高、对样本损耗量大。

相较于Fludigm的C1系统和Wafergen系统，基于液滴微流控原理的10×genomics和Dolomite通量更高，利用微流控芯片将带有标签的微珠和单细胞包裹在一个液滴中，实现单细胞的分离与标记，可以同时对上万个细胞进行分析。但是，Dolomite系统在破乳的时候，微珠上空载的引物容易结合游离mRNA，交叉污染大；形成的文库无法直接环化，不能直接连用BGISeq-500平台；需要额外的文库转换，引入数据偏差，降低数据有效使用率。而10×genomics对样本要求高，成本高；形成的文库也无法直接环化，不能直接连用BGISeq-500平台；同样的，需要额外的文库转换，引入数据偏差，降低数据有效使用率。

此外还有一些单细胞分离技术，例如口吸管、流式细胞仪等。但是，口吸管，显微操作，该方法通量低，耗时长，过程繁琐。流式细胞仪样本需求量大，需要精准控制，并且，对细胞有损伤，对后续建库要求高。

总的来说，目前现有的单细胞分离或单细胞转录组测序技术，受制于通量、成本等问题，很多大规模的研究工作无法展开。一方面，通量低较难实现细胞异质性和不同细胞亚群的细致分析。另一方面，提高通量后导致的双包率增高，成为目前高通量平台的一个瓶颈。

发明内容

本申请的目的是提供一种新的高通量的单细胞转录组测序方法和试剂盒。

本申请具体采用了以下技术方案：

本申请的第一方面公开了一种高通量的单细胞转录组测序方法，包括采用液滴生成系统将单细胞与带有标签的微珠包裹在一个液滴中，并且，在液滴中进行逆转录获得第一链cDNA。