[发明专利]基于进化信息构建嵌合SaCas9用于增强和扩展PAM位点的识别

权利要求书

1.一种Cas9蛋白突变体，其特征在于，其具有：

框架区；和

PAM识别区，所述PAM识别区识别下列核酸序列的至少之一：

5’-NNNRRT-3’，N＝A、T、G或C、R＝A或G；

5’-NNNRRN-3’，N＝A、T、G或C、R＝A或G；

5’-NNNRCN-3’，N＝A、T、G或C、R＝A或G；

5’-NNNRTN-3’，N＝A、T、G或C、R＝A或G；

5’-NNNCAA-3’，N＝A、T、G或C；

5’-NNNCAT-3’，N＝A、T、G或C；

5’-NNNCGT-3’，N＝A、T、G或C；

5’-NNNCGC-3’，N＝A、T、G或C；

5’-NNNGTN-3’，N＝A、T、G或C；

5’-NNNTCN-3’，N＝A、T、G或C；

5’-NNNTTC-3’，N＝A、T、G或C；

5’-NNNTTG-3’，N＝A、T、G或C；

5’-NNNTTT-3’，N＝A、T、G或C，

其中，相对于saCas9，所述PAM识别区与982IGVNNDLLNRIEV 994相比具有下列突变的至少之一：

第982位突变为T、K、R或L，

第983位突变为A、C或S，

第984位突变为T、D，

第985位突变为F、S、A、N，

第986位突变为E、D、H、A、M，

第987位突变为S、G、N、S、D、E、P，

第988位突变为D、K、T、S、T、D、K、R、E、A，

第989位突变为R、A、N、Q、G、E、T、K、S、G、H、V，

第990位突变为S，

第991位突变为I、V、L、K、T、M，

第992位突变为V、L，

第993位突变为Q，

第994位突变为L、M、C、I、A；

其中，所述PAM识别区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3～SEQ ID NO:43所示；所述框架区的氨基酸序列如SEQ ID NO：1～2、130所示；所述Cas9蛋白突变体的氨基酸序列如SEQ IDNO:44～84、131所示。

2.一种核酸，其特征在于，所述核酸编码权利要求1所述的Cas9蛋白突变体。

3.根据权利要求2所述的核酸，其特征在于，所述核酸具有SEQ ID NO:85～125、132任一所述的核苷酸序列。

4.一种试剂盒，其特征在于，包括：

第一核酸分子，所述第一核酸分子编码权利要求1所述的Cas9蛋白突变体；以及

第二核酸分子，所述第二核酸分子编码gRNA。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述第一核酸分子具有SEQ ID NO:85～125、132任一所述的核苷酸序列。

6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述第二核酸分子是SEQ ID NO:127～129任一所述的核苷酸序列。

7.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述第一核酸分子、第二核酸分子负载在同一表达载体上。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述同一表达载体为腺病毒载体。

9.一种对细胞进行基因改造的方法，其特征在于，将第一核酸分子和第二核酸分子引入待改造的细胞中，所述第一核酸分子和所述第二核酸分子是如权利要求4～8任一项所述的，所述方法用于非疾病诊断或治疗目的。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述Cas9蛋白突变体的PAM识别区序列和所述gRNA序列是基于待改造的基因序列确定的。