[发明专利]引物、引物组合、试剂盒及其应用

说明书

本发明涉及生物技术领域，特别涉及引物、引物组合、试剂盒及其应用。本发明利用多种混合引物一次数字微滴定量PCR(digital droplet PCR)在cDNA水平上特异性检出至少17种NPM1突变。主要针对AML治疗后微小残留病变的检测，也可用于初诊患者鉴定有无NPM1突变。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及引物、引物组合、试剂盒及其应用。

背景技术

微小残留病变(MRD)是指血液系统肿瘤在接受治疗后获得组织形态学缓解，无临床症状但仍然存在在体内的亚显微镜病变。目前临床多用PCR和流式细胞仪进行检测。

急性髓细胞白血病(AML)是成人白血病中最大一个种类，约占50％-70％，是重要的致死性疾病。近年来随着治疗方法的不断改进，获得形态学缓解的患者比率越来越高，但大部分病人在获得缓解后仍然复发。了解获得显微镜下的形态学缓解患者体内是否存在肿瘤细胞，进而决定是否需要进一步治疗，是预防复发的关键步骤。然而，由于AML的异质性，对于缓解期的AML患者进行MRD检测没有统一的方法。最常用的方法是利用AML细胞中的融合基因进行检测。但所有融合基因(如PML-RARA,AML1-ETO)阳性的患者加在一起占AML的比率为30％，大多数AML没有特异性的融合基因。其它基因突变是否可以作为AML跟踪的标志一直存在争论，因为一些突变(如DNMT3A)在获得长期缓解的患者的骨髓细胞中仍然存在。另外，做为MRD跟踪的标志也需在AML患者中有一定的阳性频率。至2016年后，NPM1被公认为少数几个可做为AML MRD跟踪的标志，因为它在AML患者肿瘤细胞中持续存在，且在长期缓解患者中检出率很低，NPM1突变阳性患者占到AML的30％，是AML中主要的基因突变形式。特别是在占AML一半以上的染色体核型正常患者中，NPM1突变可达50％-70％，而这类患者肿瘤细胞没有其它很好的生物标记。

NPM1基因存在于5号染色体上，定位于5q35.1。参与DNA修复和细胞周期等多种重要生命活动。NPM1突变主要发生在急性髓细胞性白血病中，至少有27种突变(见图1，图2)。它集中在第12外显子，位点在956至971之间，为1到2个四联核苷酸插入或4-5个核苷酸缺失伴随9个核苷酸插入。它导致错义突变，从而缩短阅读框，使DNA结合区失去功能。

目前临床上有多种检测NPM1突变的方法，主要目的均集中在发现初诊或复发白血病患者中是否有NPM1突变。方法包括PCR后一代(Sanger)测序和普通荧光定量PCR。PCR后一代(Sanger)测序方法存在灵敏度问题。由于白血病细胞中的NPM1突变是杂合子，即便样品中100％是白血病细胞PCR后测序阅读结果也不特别清晰，正常和突变碱基交织在一起(见图3(A)～图3(C)和图4)。当整个样本中的白血病细胞在10％时，几乎就看不出突变。而在白血病患者中，外周血中白血病细胞少于30％并不少见。如大部分急性早幼粒白血病(APL)患者。因此，PCR后Sanger测序方法对NPM1突变的检测甚至不能用于初诊患者的外周血。至于包含了针对A、B、D三个主要突变的的普通荧光定量PCR法则较繁琐且适用面窄。因为它要同时做三个荧光定量PCR，且一旦突变不在三种(而是其它几十种中的一种，约占15％-20％NPM1突变)之内，则结果为假阴性。

至于微小残留病变的检测，PCR后一代(Sanger)测序方法由于灵敏度的关系当然不适合，因为初诊NPM1突变阳性的缓解期患者绝大多数细胞只含有野生型NPM1,PCR后测序结果会覆盖突变型的信号。而针对三个主要突变的的荧光定量PCR法虽也可以用于MRD检测，但它必须首先知道NPM1突变测序结果，否则如上所述会很繁琐(至少做三个独立的实验)且不可靠，因为阴性结果不能排除患者存在三种主要突变外的其它NPM1突变。另外，人们也用ASO-PCR方法进行MRD检测，即根据每个患者测序结果设计特异性的引物或探针，繁琐而昂贵。