[发明专利]一种基于DTM1基因的转基因水稻不育系的培育方法

权利要求书

1.一种基于DTM1基因的转基因水稻不育系的培育方法，其特征在于它包括以下步骤：

A、水稻基因表达盒DTM1的获得；

B、tdTomato基因表达盒的获得；

C、玉米花粉特异性启动子Pg47的扩增；

D、玉米花粉致死基因ZMAA1的扩增；

E、各基因表达元件的连接。

2.根据权利要求1所述基于DTM1基因的转基因水稻不育系的培育方法，其特征在于所述步骤E、各基因表达元件的连接步骤包括：

第一步，连接DTM1，利用上下游引物中引入的Smal和CacI酶切位点和pCAMBIA1300双元载体上的Smal和CacI酶切位点，将完整的水稻DTM1基因连接到pCAMBIA1300载体上；

第二步，利用上下游引物中引入的BaII和KpnI酶切位点和pCAMBIA1300双元载体上BaII和KpnI酶切位点，将tdTomato基因表达元件连接到第一步已经连接上水稻DTM1基因的pCAMBIA1300载体上；

第三步，利用上下游引物中引入Kpn I和Sma I酶切位点和pCAMBIA1300双元载体上的Kpn I和Sma I酶切位点，将玉米花粉特异性启动子Pg47连接到前两步已经连接上水稻DTM1基因、tdTomato基因表达元件和玉米花粉特异性启动子Pg47的pCAMBIA1300载体上；

第四步，利用上下游都引入的Afl2酶切位点，将玉米花粉致死基因ZMAA1通过单酶切位点连接到已经连有水稻DTM1基因和tdTomato基因表达元件的pCAMBIA1300双元载体上。

3.根据权利要求1所述基于DTM1基因的转基因水稻不育系的培育方法，其特征在，所述步骤A、水稻基因表达盒DTM1的获得，进一步包括：

提取水稻植株的基因组DNA，以基因组DNA为模板，以F2/R2为上下游引物进行完整DTM1基因表达盒的扩增，扩增过程中分别在上游引物和下游引物中引入Sma I和CacI酶切位点，其扩增的水稻DTM1基因包含其上游的启动子和下游的终止子，同时包含所有的外显子和内含子。

4.根据权利要求1所述基于DTM1基因的转基因水稻不育系的培育方法，其特征在，所述步骤B、tdTomato基因表达盒的获得，进一步包括：

以含有tdTomato基因完整表达盒的质粒为模板，以F1/R1为上下游引物进行扩增，扩增过程中分别在上下游引物中引入BaII和Kpn I位点，同时在下游引物引入的KpnI位点前面加入Afl2酶切位点。

5.根据权利要求1所述基于DTM1基因的转基因水稻不育系的培育方法，其特征在，所述步骤C、玉米花粉特异性启动子Pg47的扩增，进一步包括：

以玉米基因组DNA为模板，以F4/R4为上下游引物进行花粉特异性启动子Pg47扩增，在上下游引物中分别引入Kpn I和Sma I酶切位点。

6.根据权利要求1所述基于DTM1基因的转基因水稻不育系的培育方法，其特征在，所述步骤D、玉米花粉致死基因ZMAA1的扩增，进一步包括：

以玉米基因组DNA为模板，以F3/R3为上下游引物进行玉米花粉致死基因ZMAA1的扩增，在上下游引物中引入Afl2酶切位点；其扩增的致死基因ZMAA1包含所有的外显子和内含子。

7.权利要求1～6中任一项所述方法选育的基于DTM1基因的转基因水稻不育系。

8.权利要求1～6中任一项所述基于DTM1基因的转基因水稻不育系的培育方法在水稻不育系育种中的应用。