[发明专利]一种基于单克隆抗体检测人proGRP的双夹心ELISA试剂盒

权利要求书

1.一种基于单克隆抗体检测人proGRP的双夹心ELISA试剂盒，其特征在于，该试剂盒的内容物组成如下：

96孔ELISA酶标板；

包被抗体，该包被抗体是由针对人proGRP中30-41aa结构域的小鼠抗人单克隆抗体EP1-1以及针对人proGRP中69-80aa结构域的小鼠抗人单克隆抗体EP2-3和EP2-4组成的混合物，混合比例为2：1：1，工作总浓度为20μg/mL；

人proGRP标准蛋白，该人proGRP标准蛋白通过真核蛋白纯化的方法获得；

生物素标记的检测抗体，该生物素标记的EP3-1-biotin，是针对人proGRP中83-94aa结构域的小鼠抗人单克隆抗体，工作浓度为5μg/mL；

Avidin与HRP的交联蛋白、包被缓冲液、封闭液、样品及检测抗体稀释液、ELISA酶标板洗涤液、底物液和终止液；其中：

所述的包被缓冲液为0.05M的碳酸盐缓冲液，pH为9.6；

所述封闭液为含体积分数为10％小牛血清的磷酸盐缓冲液，pH为7.4；

所述样品及检测抗体稀释液为含体积分数为1％小牛血清的磷酸盐缓冲液，pH为7.4；

所述ELISA酶标板洗涤液为含体积分数为0.10％Tween-20的磷酸盐缓冲液，pH为7.4；

所述底物液为TMB；

所述终止液为摩尔浓度为2M的浓硫酸溶液；

所述的Avidin与HRP的交联蛋白是采用过碘酸钠法获得。

2.如权利要求1所述的基于单克隆抗体检测人proGRP的双夹心ELISA试剂盒，其特征在于，所述的过碘酸钠方法是将HRP与过碘酸钠反应，获得活化的HRP，然后Avidin与活化的HRP反应，得到Avidin与HRP的交联蛋白。

3.权利要求1或2所述的基于单克隆抗体检测人proGRP的双夹心ELISA试剂盒的构建方法，其特征在于，运用蛋白质三维结构预测软件预测proGRP的线性表位EP1：30-41aa；EP2：69-80aa；EP3：83-94aa，用偶联多肽的方法进行小鼠免疫；所述多肽偶联方法其一是通过原核表达融合HBV-C/表位小肽蛋白增强小肽的免疫原性；其二是通过使用表位小肽修饰Ad5腺病毒E1区与Hexon区增强其免疫原性；其三是通过融合蛋白与修饰腺病毒交叉免疫小鼠，产生针对特定抗原表位的抗体。

4.权利要求1或2所述的基于单克隆抗体检测人proGRP的双夹心ELISA试剂盒用于制备小细胞肺癌病人的血清学检测试剂盒的应用，所述小细胞肺癌病人的血清学检测是检测重组的proGRP蛋白以及天然的人proGRP蛋白；

检测重组的proGRP蛋白以及天然的人proGRP蛋白具体步骤包括：

(1)包被ELISA酶标板：用包被缓冲液将包被抗体EP1-1、EP2-3和EP2-4按比例稀释成20μg/mL，100μL/孔，4℃过夜；

(2)封闭：甩去孔中液体，加入200μL/孔的ELISA酶标板洗涤液，洗涤3-5次后，加入200μL/孔的封闭液，37℃、2h后，洗涤3-5次，并甩干；

(3)加待检测样品：向所述酶标板中加入待检测样品，100μL/孔，37℃、1h后，洗涤3-5次，并甩干；

(4)加检测抗体：向所述酶标板中加入检测抗体EP3-1-biotin，100μL/孔，37℃、1h后，洗涤3-5次，并甩干；

(5)加Avidin与HRP的交联蛋白：向所述酶标板中加入Avidin与HRP的交联蛋白，100μL/孔，37℃、1h后，洗涤5-6次，并甩干；

(6)化学发光：向所述酶标板中加入显色液，100μL/孔；

(7)显色：加入显色液后，37℃避光显色5分钟，置于酶标仪中检测450nm吸光值。