[发明专利]一种耐酸菌超分辨成像染料及其合成方法和应用

说明书

一种耐酸菌超分辨成像染料及其合成方法和应用，该染料具体分子结构以琥珀酰亚胺活性酯取代的罗丹明螺酰胺为基本结构单元，其结构式如下(1)所示：本发明开发的耐酸菌超分辨成像染料不仅具有耐酸的性能，而且保留了可见光激活性能。因此这类耐酸菌超分辨成像染料可以应用于超分辨成像技术中不受酸性环境的干扰。

技术领域

本发明属于荧光染料和成像领域，具体涉及一种耐酸菌超分辨成像染料及其合成方法和应用。

背景技术

近年来发展的一系列超高分辨率成像技术，其中基于单分子定位的光激活定位显微技术(PLAM)和随机光学重构显微技术(STORM或dSTORM)使光学显微镜的空间分辨达到了前所未有的高度。目前超分辨显微成像技术已经被广泛应用到生命科学研究中，然而尽管超分辨显微成像技术取得了巨大的进步，将荧光显微镜的空间分辨率推进到了20纳米。

开发生物成像用单分子定位超分辨荧光染料，目前最好的方法是在高荧光强度和光稳定性的染料中引入光开关功能。罗丹明类染料由于其突出的光性能，是目前超分辨中用的最多的一类染料，特别是硅罗丹明的性能更加突出，在超分辨中的应用受到广泛关注。罗丹明染料的荧光“明-暗”状态是基于酰胺螺环开关，传统罗丹明螺酰胺在紫外光辐照下，会由不发光的闭环结构变为强荧光发射的开环结构。S.W.Hell等人最早利用这一独特的光化学反应将罗丹明螺酰胺标记在固定的PtK2细胞的微丝骨架上，利用单分子定位技术实现了超分辨成像。但是，包括罗丹明螺酰胺在内，光开关分子在细胞内应用所面临的共同难题是需要紫外光作为“开-关”激发光，例如罗丹明螺酰胺需要用波长小于375nm的光来将闭环结构打开变为有荧光的开环结构，而紫外光会对细胞产生严重的光毒性，难以在活细胞中应用。为了改善激活光波长，W.E.Moerner等人将酰胺取代基修饰为较大的共轭体系，将吸收波长向长波长移动，首次将开关激发光延长到可见光区(400nm)，实现了对细菌表面的三维超分辨荧光成像。由此，罗丹明螺酰胺在超分辨成像中表现出巨大潜力。

尽管罗丹明螺酰胺作为光激活染料已经可以用于超分辨荧光成像，但是这类染料分子还有一些不足还需要改进，首先是酸激活荧光干扰，通常情况下酸激活和光激活是两种都能够打开罗丹明酰胺螺环的方式。细胞内存在许多偏酸性的环境(如溶酶体，酸性蛋白等)，当罗丹明螺酰胺染料使用于这些酸性环境中，其酸激活产生的荧光会严重干扰甚至导致光激活性能完全失效，因此在酸性环境中基于这类染料的荧光探针目前无法应用于超分辨荧光成像。此外，一些嗜酸微生物生长的最适pH常在4以下，典型的例如嗜酸微生物如酸矿水中的化能自养硫氧化细菌和自热的煤堆和酸热泉中的嗜热嗜酸细菌等，而这些嗜酸菌嗜酸的奥秘仍未解开，若要将超分辨成像在这个领域加以应用，传统会被酸激活的罗丹明螺酰胺类染料显然也是不合适的。令人遗憾的是，目前报道的绝大多数罗丹明螺酰胺都只能用紫外光(＜375nm)辐照来实现光激活荧光，而紫外光对生物体具有光毒性不利于活细胞超分辨成像。尽管S.W.Hell等人使用了长波长的双光子激光激活罗丹明螺酰胺的荧光并应用于超分辨成像，但是双光子激光功率要比单光子激光大几个数量级，这也会对成像的生物体造成不可修复的光损伤。W.E.Moerner等人开发的可见光激活染料最大吸收波长约为380nm，仅在405nm左右有一点吸收带边，因此也不能高效地利用405nm激光实现光激活。综上所述，开发一类具有耐酸性同时在可见激光波长(405nm)具有最大吸收值的罗丹明螺酰胺类荧光开关染料对于活细胞超分辨荧光成像显得尤为迫切和重要。

发明内容

本发明提供了一种耐酸菌超分辨成像染料及其合成方法和应用，具体结构以罗丹明螺酰胺为基本单元，将琥珀酰亚胺(NHS)活性酯共价连接到罗丹明螺酰胺分子上，通过NHS活性酯即可以将这类荧光开关探针非特异性标记到活细菌细胞表面的膜蛋白上，通过STORM技术就可以对细菌表面进行超分辨成像。

本发明所述的一种耐酸菌超分辨成像染料，其结构式如下所示：

本发明还提供了一种耐酸菌超分辨成像染料的合成方法，合成路线如下：