[发明专利]多光子激发的近红外二区荧光寿命显微成像系统

说明书

本发明公开了一种多光子激发的近红外二区荧光寿命显微成像系统。本发明中1220nm飞秒激光被引入到奥林巴斯正置扫描显微镜，经过近红外增透物镜聚焦于样品，近红外二区荧光信号由大口径光纤准直器收集后耦合进近红外增透大口径光纤，最终被近红外二区响应的光电倍增管探测转换成电信号，电信号由信号放大器放大后转换成电计数信号输入TCSPC计数板卡，同时TCSPC计数板卡接收到来自激光器的同步脉冲信号，将其作为计时停止信号，用以计算出所接收光子的时间信息，经计算机处理后，得到样品的近红外二区双光子荧光寿命图像和近红外二区双光子荧光强度图像。本发明简单实用、稳定性好、使用方式灵活。

技术领域

本发明属于应用光学的显微生物成像领域，涉及一种多光子激发的近红外二区荧光寿命显微成像系统。

背景技术

一、多光子激发的近红外二区荧光显微成像

根据生物组织窗口的相关理论，近红外二区（1000～1700nm）荧光在生物组织中具有较强的穿透能力，有利于实现大深度成像，并且生物组织不具备这一波段的自发荧光，因此图像具有较高的信噪比。目前，市场上已有商用的近红外二区荧光宏观成像系统，可以实现生物标本（如小鼠）的近红外二区荧光宏观（全身）成像。然而这种成像方式空间分辨率较低，且缺乏生物样品的深度信息。

为解决这一问题，人们开发出了激光逐点扫描和光电倍增管逐点探测的三维显微成像方式，它主要有两种类型：单光子荧光共聚焦扫描成像和多光子荧光扫描成像（包括双光子，三光子激发等）。本发明在第二种类型：“多光子激发的近红外二区荧光扫描显微成像系统”的基础上，进一步引入时间相关单光子计数(TCSPC)技术，实现多光子激发的近红外二区荧光寿命显微成像。

二、时间相关单光子计数——TCSPC（Time-Correlated Single PhotonCounting）。

TCSPC技术是20世纪60年代晚期开始出现的一种极弱光探测技术。早期由于光源重复频率低和电子学系统速度慢的限制，TCSPC技术的采集时间相对较长。经过20多年的发展，该技术已经从一种慢速、一维的荧光寿命测量技术，发展成为一种快速、多维的光学信号记录技术。现在，先进的TCSPC技术已被广泛应用于单分子光谱、荧光相关光谱、时间分辨激光扫描显微成像和扩散光学层析成像等领域。

目前，商用的基于TCSPC技术的时间分辨激光扫描显微成像系统，其基本原理如下：记录下所探测的每一个光子的时间信息（t）和像素位置信息（X，Y），分别存入不同的内存。（X,Y）这两个参数表征该光子属于图像的哪个像素点，根据这两个参数的不同，可以把所探测到的光子分配给图像上不同的像素点；t这一参数表明该光子所处的激光脉冲周期的时间位置，根据这一参数的不同，可以把所探测到的光子按照时间分布累积起来，进而拟合出荧光衰减曲线，得到样品每个像素点上的荧光寿命。此外，每个像素点上累积的光子数能代表该像素的总体光强度，于是一幅光强度成像图也可以被重构出来。然而，目前该商用成像系统主要存在以下两点不足：

1.主要用于探测可见光波段（380～780nm）的微弱荧光。由于实验室环境中可见光波段的杂散光较多，为防止系统过曝，需要做严格的遮光处理并且对激发光功率也有严格限制，以防样品过亮而使成像过曝——这些限制都对实验条件提出了严格要求。

2.可见光波段对于大深度的生物显微成像而言并非最优，而波长位于近红外二区（1000～1700nm）的光在生物组织中的散射较小，并且生物组织在近红外二区波段的自发荧光相对较小，因此基于近红外二区的荧光生物成像具有大深度、高分辨率、高信噪比的特点。而且实验室环境中的近红外杂散光很少，所以不需要非常严格的遮光处理。